Sistema y método para la caracterización de células.

Un método para caracterizar células o estructuras celulares en una muestra queconsiste en:

obtener al menos una respuesta de impedancia normalizada de la muestrasobre al menos una gama de frecuencias (60), donde la impedancianormalizada es una impedancia medida dividida en cada frecuencia en lagama de frecuencias entre una impedancia de referencia para la frecuenciacorrespondiente, donde la impedancia medida comprende una parte real y/oimaginaria, y la impedancia de referencia es una respuesta de impedancia delsistema sobre la gama de frecuencias prácticamente sin células en unatrayectoria eléctrica entre al menos dos electrodos (25); y caracterizar almenos una célula usando al menos una característica de la respuesta deimpedancia normalizada (75).

La presente invención hace referencia a un sistema y método para caracterizar células y estructuras formadas a partir de células.

Antecedentes de la invención [0002] Se han presentado varias técnicas para monitorizar el crecimiento y otras características de células biológicas. Una de las técnicas implica el uso de métodos de impedancia, como los presentados por Und R et al. en “Single Cell Mobility and

Adhesion Monitoring Using Extracellular Electrodes”, Biosensors and Bioelectronics, 6

(4) , págs. 359-367, 1991. Otras técnicas presentadas suponen determinar cambios en la impedancia y unirlos al movimiento o crecimiento celular o bacteriano. [0003] La mayoría de estas técnicas conlleva medir la impedancia de CA de las células o bacterias en los medios de cultivo adecuados. Se ha conseguido un buen nivel de éxito usando estos métodos para unir los cambios generales en la impedancia, Z, en algunas frecuencias fijas eléctricas estimulantes, normalmente en la gama de los kilohercios, al crecimiento de células o bacterias. Sin embargo, el uso de las técnicas de impedancia para monitorizar el crecimiento u otras características de células biológicas es complicado por el hecho de que cada sistema de medición tiene su propia impedancia característica, que debe separarse de la respuesta de impedancia de las células.

Resumen de la invención [0004] Según un primer aspecto de la presente invención, se presenta un método para caracterizar células o estructurares celulares en una muestra como se reivindica en la reivindicación 1. [0005] Al monitorizar la respuesta de frecuencia de la impedancia normalizada sobre un espectro de frecuencias, se ha hallado que pueden identificarse rasgos característicos en la respuesta de frecuencia de la impedancia normalizada y usarse para clasificar células de manera consistente y repetible. El uso de la impedancia normalizada tiene la ventaja adicional de que no es necesario caracterizar los electrodos de manera continua y separada. Además, la técnica de impedancia de CA es rápida, simple y al eliminarse la necesidad de una constante recalibración se permite una monitorización continua de los cultivos celulares.

La gama de frecuencias puede ser una gama o espectro de frecuencias continuo o cuasi continuo. La gama de frecuencias puede comprender una serie de mediciones de frecuencias discretas. La gama de frecuencias puede ser cualquier gama de frecuencias comprendida entre 0, 1 Hz y 33 MHz. [0007] El método puede incluir presentar un sistema que tiene al menos dos electrodos. La muestra puede presentarse en una trayectoria eléctrica entre los electrodos. [0008] La al menos una célula puede ser una bacteria u otro organismo unicelular. La al menos una célula puede ser una célula animal o vegetal tal como una célula de un tejido animal o vegetal. Al menos una célula puede organizarse en una estructura, que puede ser tejido animal o vegetal o un organismo multicelular. [0009] El método puede comprender obtener una respuesta de impedancia de referencia del sistema sobre la al menos una gama de frecuencias. [0010] La respuesta de impedancia de referencia puede obtenerse midiendo la respuesta de impedancia del sistema sobre la gama de frecuencias prácticamente sin células en una trayectoria eléctrica entre los electrodos. [0011] La respuesta de impedancia de referencia puede ser una respuesta de impedancia del sistema inicial o calculada o estimada o estándar. La respuesta de impedancia de referencia puede obtenerse midiendo la respuesta de impedancia de un sistema similar y/o estandarizado sobre la al menos una gama de frecuencias prácticamente sin células en una trayectoria eléctrica entre los electrodos. [0012] El método puede comprender obtener al menos una respuesta de impedancia medida del sistema sobre la al menos una gama de frecuencias. [0013] La al menos una respuesta de impedancia medida del sistema sobre la al menos una gama de frecuencias puede obtenerse tras la introducción y/o cultivo de al menos una célula en la trayectoria eléctrica entre los electrodos. [0014] Obtener la al menos una respuesta de impedancia normalizada puede comprender dividir la al menos una respuesta de impedancia medida del sistema en cada frecuencia en la gama de frecuencias entre la respuesta de impedancia de referencia del sistema para la frecuencia correspondiente. [0015] La al menos una característica de la respuesta de impedancia normalizada puede depender de la frecuencia. La al menos una característica de la respuesta de impedancia normalizada puede ser la frecuencia y/o el tamaño del pico y/o la forma del pico de al menos un pico en la respuesta de impedancia normalizada sobre la gama de frecuencias. Pueden observarse múltiples picos en la impedancia normalizada. El pico o picos pueden depender de la actividad celular o bacteriana.

Tales picos únicos o múltiples pueden usarse para determinar la etapa de crecimiento de un sistema celular o bacteriano. Los cambios en al menos un pico obtenidos en el sistema normalizado pueden monitorizarse a lo largo del tiempo para permitir la distinción de los cambios en el crecimiento celular o bacteriano. [0016] El al menos un pico en la impedancia normalizada con frecuencia puede ser característico del tipo celular o bacteriano y/o de la etapa de crecimiento. Por lo tanto, la impedancia normalizada puede usarse para determinar la presencia de un tipo de tejido, célula, bacteria o subproducto molecular particular en el sistema. [0017] Los electrodos pueden sumergirse en un medio de cultivo. El medio de cultivo puede disponerse para promover el crecimiento de al menos un tipo de células. La al menos una célula puede contenerse en el medio. La al menos una célula puede estar en contacto con uno o más de los electrodos. [0018] La medición de la respuesta de impedancia del sistema y/o la respuesta de impedancia de referencia del sistema y/o la respuesta de impedancia normalizada del sistema puede realizarse usando técnicas de impedancia de CA. [0019] Según un segundo aspecto de la presente invención, se presenta un sistema para caracterizar células o estructuras celulares en una muestra como se reivindica en la reivindicación 12. [0020] El controlador puede disponerse para determinar la impedancia a través de técnicas de impedancia de CA. [0021] Los electrodos pueden adaptarse para ser sumergidos en un medio de cultivo. Los electrodos pueden ser electrodos de oro, de cloruro de plata o de carbono. Los electrodos pueden ser electrodos planos. Los electrodos pueden colocarse para una medición in vitro o in vivo. [0022] Los electrodos pueden fijarse a un dispositivo implantable y/o al menos formar parte del mismo. El dispositivo implantable puede ser un stent cardíaco, una válvula cardíaca de metal o una válvula de tejido sujeta a un dispositivo fijador de metal o stent, un stent vascular o una superficie metálica de una articulación implantable tal como una articulación coxofemoral. [0023] La gama de frecuencias puede ser preferiblemente cualquier gama de frecuencias comprendida entre 0, 001 Hz y 33 MHz. Opcionalmente la gama de frecuencias puede ser cualquier gama de frecuencias por encima de 0, 001 Hz. En algunas aplicaciones, puede usarse corriente o voltaje de CC para los cálculos de normalización y referencia. [0024] El sistema puede disponerse para obtener una respuesta de impedancia de referencia sobre una gama de frecuencias. [0025] El sistema puede disponerse para obtener al menos una respuesta de impedancia medida sobre la gama de frecuencias. La al menos una respuesta de impedancia medida puede incluir tanto partes reales como imaginarias de la impedancia o puede incluir solo partes reales o solo imaginarias de la impedancia. [0026] El sistema puede adaptarse para obtener la al menos una respuesta de impedancia normalizada dividiendo la al menos una respuesta de impedancia medida del sistema en cada frecuencia en la gama de frecuencias entre la respuesta de impedancia de referencia del sistema para la frecuencia correspondiente.

Breve descripción de los dibujos [0027] A continuación se describirán varios aspectos de la invención a modo de ejemplo solo con referencia a los dibujos adjuntos, de los cuales:

La figura 1 es un sistema para caracterizar células;

La figura 2 es un diagrama de flujo de un método para caracterizar células;

La figura 3 muestra la respuesta de frecuencia de la impedancia normalizada de células musculares lisas obtenida usando el sistema de la figura 1 y el método de la figura 2;

La figura 4 muestra la respuesta de frecuencia de la impedancia normalizada de células musculares lisas, células epiteliales y células endoteliales obtenida usando el sistema de la figura 1 y el método de la figura 2; y

La figura 5 muestra la respuesta... [Seguir leyendo]

1. Un método para caracterizar células o estructuras celulares en una muestra que

consiste en: obtener al menos una respuesta de impedancia normalizada de la muestra sobre al menos una gama de frecuencias (60) , donde la impedancia normalizada es una impedancia medida dividida en cada frecuencia en la gama de frecuencias entre una impedancia de referencia para la frecuencia correspondiente, donde la impedancia medida comprende una parte real y/o imaginaria, y la impedancia de referencia es una respuesta de impedancia del sistema sobre la gama de frecuencias prácticamente sin células en una trayectoria eléctrica entre al menos dos electrodos (25) ; y caracterizar al menos una célula usando al menos una característica de la respuesta de impedancia normalizada (75) .

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la gama de frecuencias es una gama o un espectro de frecuencias continuo o cuasi continuo y/o en el que la gama de frecuencias comprende una serie de mediciones de frecuencias discretas.

3. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la al menos una célula es una bacteria u otro organismo unicelular y/o la al menos una célula es una célula animal o vegetal tal como una célula de un tejido animal o vegetal y/o al menos una célula se organiza en una estructura, tal como tejido animal o vegetal o un organismo multicelular.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la respuesta de impedancia de referencia se obtiene midiendo la respuesta de impedancia del sistema sobre la gama de frecuencias prácticamente sin células en una trayectoria eléctrica entre al menos dos electrodos (25) .

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en el que la respuesta de impedancia de referencia es una respuesta de impedancia del sistema inicial o calculada o estimada o estándar, en el que opcionalmente la respuesta de impedancia de referencia se obtiene midiendo la respuesta de impedancia de un sistema similar y/o estandarizado sobre la al menos una gama de frecuencias prácticamente sin células en una trayectoria eléctrica entre al menos dos electrodos (25) .

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la

al menos una respuesta de impedancia medida del sistema sobre la al menos una gama de frecuencias se obtiene tras la introducción y/o cultivo de al menos una célula en la trayectoria eléctrica entre al menos dos electrodos (25) .

7. Método de acuerdo con cualquiera con las reivindicaciones anteriores, en el que la al menos una característica de la respuesta de impedancia normalizada es la frecuencia y/o el tamaño del pico y/o la forma del pico de al menos un pico en la respuesta de impedancia normalizada sobre la gama de frecuencias.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que se usa el al menos un pico para determinar la etapa de crecimiento de al menos un sistema celular o bacteriano, en el que opcionalmente los cambios en al menos un pico en el sistema normalizado se monitorizan a lo largo del tiempo para permitir la distinción de cambios en el crecimiento celular o bacteriano.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que al menos un pico en la impedancia normalizada con frecuencia es característico de un tipo celular o bacteriano y/o de una etapa de crecimiento y la impedancia normalizada se usa para determinar la presencia de un tipo de tejido, célula, bacteria o subproducto molecular particular en el sistema.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos dos electrodos (25) usados para obtener la respuesta de impedancia normalizada se sumergen en un medio de cultivo, en el que opcionalmente el medio de cultivo se dispone para promover el cultivo de al menos un tipo de células.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la medición de la respuesta de impedancia del sistema y/o la respuesta de impedancia de referencia del sistema y/o la respuesta de impedancia normalizada del sistema se realiza usando técnicas de impedancia de CA.

12. Un sistema (5) para caracterizar células o estructuras celulares en una muestra que comprende: al menos dos electrodos (25) conectados a un controlador (15) , controlador (15) que se adapta para obtener al menos una respuesta de impedancia normalizada de la muestra sobre una gama de frecuencias a través de los electrodos dividiendo una impedancia medida en cada frecuencia en la gama de frecuencias entre una impedancia de referencia para la frecuencia correspondiente, donde la impedancia de referencia es una respuesta de impedancia del sistema sobre la gama de frecuencias prácticamente sin células en una trayectoria eléctrica entre al menos dos electrodos (25) ; y caracterizar al

menos una célula o estructura celular usando al menos una característica de la respuesta de impedancia normalizada, donde opcionalmente el controlador (15) está dispuesto para determinar la impedancia a través de técnicas de impedancia de CA.

13. Sistema (5) de acuerdo con la reivindicación 12, en el que los electrodos están adaptados para ser sumergidos en un medio de cultivo y/o en el que los electrodos son electrodos de oro, de cloruro de plata o de carbono y/o en el que los electrodos están fijos a un dispositivo implantable y/o al menos forman parte del mismo, en el que opcionalmente el dispositivo implantable es un stent

cardíaco, una válvula cardíaca de metal o una válvula de tejido sujeta a un dispositivo fijador de metal o stent, un stent vascular o una superficie metálica de una articulación implantable tal como una articulación coxofemoral.

14. Método o sistema (5) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la gama de frecuencias es cualquier gama de frecuencias 15 comprendida entre 0, 001 Hz y 33 MHz.

15. Sistema (5) de acuerdo con la reivindicación 14, adaptado para obtener la al menos una respuesta de impedancia normalizada dividiendo la al menos una respuesta de impedancia medida del sistema en cada frecuencia en la gama de frecuencias entre la respuesta de impedancia de referencia del sistema para la frecuencia correspondiente.

16. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o sistema (5) de acuerdo con la reivindicación 12, en el que se usa una corriente o voltaje de CC para determinar la impedancia normalizada.

Preparar célula y llenar célula con medio de cultivo fresco (40)

Medir respuesta de impedancia de referencia sobre la gama de frecuencias f (45)

Introducir muestra

(50)

Medir la respuesta de impedancia sobre la gama de frecuencias f (55)

Determinar la respuesta de impedancia normalizada sobre la gama de frecuencias f (60)

Determinar la posición de cualquier pico en la respuesta de impedancia sobre la gama de frecuencias f (70)

Comparar la posición de los picos con la tabla de consulta para caracterizar células (75)

Figura 2

Figura 3

Células epiteliales Células endoteliales

Células musculares lisas CONFLUENCIA |Z| / CONTROL |Z|

Figura 4