Gomas de diutano de alta viscosidad y métodos para su producción.

Una goma de diutano que muestra una viscosidad intrínseca mayor que 150 decilitros/gramo cuando la viscosidad intrínseca se obtiene representando gráficamente la viscosidad reducida frente a la concentración de la disolución,

y extrapolando una regresión lineal de los datos hasta la concentración cero,

y que muestra una viscosidad en agua salada 3 rpm mayor o igual a 42 de la lectura del dial, cuando la lectura se toma combinando la goma de muestra con agua salada sintética y mezclando, después enfriando la disolución hasta aproximadamente 26 ºC y colocándola en una plataforma de muestras Fann, en donde la velocidad se ajusta a 3 rpm y se realiza la lectura del dial; y

en la que la goma de diutano se fabrica empleando Sphingomonas cepa ATCC n.º 53159 que comprende un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO:1.

Gomas de diutano de alta viscosidad y métodos para su producción Campo de la invención

La presente invención describe la producción de un polisacárido de diutano que muestra mayores propiedades de viscosidad, comparado con polisacáridos con el mismo tipo de unidades repetidas producidos previamente. Este polisacárido de diutano mejorado se produce a través de la generación de un derivado de Sphingomonas sp. ATCC 53159 que porta un plasmido de amplio espectro de hospedantes de múltiples copias en el que se han clonado los genes para la biosíntesis del polisacárido de diutano. El plásmido proporciona la capacidad, dentro de la cepa del hospedante de Sphingomonas, para producir múltiples copias de genes para la síntesis de este polisacárido. De tal forma, se proporciona un método que no solo aumenta la producción del polisacárido de diutano diana, sino también la producción de un polisacárido de diutano con mejores propiedades físicas (con la mayor viscosidad mencionada anteriormente). Este polisacárido de diutano ha demostrado ser particularmente útil como posible viscosificante en aplicaciones en campos petroleros y dentro de materiales de cemento. Los métodos de producción de la invención de este polisacárido de diutano mejorado, así como los nuevos genes clonados requeridos para producir el diutano mejorado con dicho método, también se incluyen en esta invención. Además, en esta invención se incluye la nueva cepa de Sphingomonas modificada que incluye la secuencia de ADN necesaria.

Antecedentes de la invención

Los polisacáridos o gomas se emplean principalmente para espesar o gelificar disoluciones acuosas y con frecuencia se clasifican en dos grupos: espesantes y agentes gelificantes. Los espesantes típicos incluyen almidones, goma de xantano, goma de diutano, goma de welano, goma de guar, carboximetilcelulosa, alginato, metilcelulosa, goma de karaya y goma de tragacanto. Los agentes gelificantes habituales incluyen gelatina, goma de gelano, almidón, alginato, pectina, carragenano, agar y metilcelulosa.

Algunos polisacáridos, o dicho más concretamente, biogomas, tales como xantano, gelano, welano y diutano, han sido producidos durante muchos años mediante fermentación a partir de microbios. Estas biogomas muestran características variadas, tales como capacidades de modificación de la viscosidad, que han permitido su utilización en muchas aplicaciones diferentes. Dentro de esta lista se incluyen agentes gelificantes para alimentos, tales como gelatinas para pastelería, mermeladas y jaleas, geles para postres, glaseados y productos lácteos, así como componentes de medios microbiológicos. Además, los agentes espesantes se emplean para una miríada de aplicaciones finales para modificar la viscosidad de líquidos diana. De particular interés es la capacidad de estas gomas para impartir modificaciones en la viscosidad a líquidos de petróleo subterráneos y/o submarinos para facilitar su recolección, aunque existen muchos otros usos finales posibles diferentes (que incluyen la producción de cemento, como un ejemplo). Se han producido diferentes biogomas a partir de diferentes fuentes bacterianas, tales como goma de xantano de Xanthomonas campestris, goma de gelano de Sphingomonas elodea, goma de welano de Sphingomonas sp. ATCC 31555, y goma de diutano (S-657) de Sphingomonas sp. ATCC 53159. En el pasado se han realizado modificaciones genéticas en dichas cepas para realizar cambios significativos en los materiales de goma resultantes producidos mediante los procedimientos de fermentación mencionados. Estas modificaciones han permitido cambios como la eliminación de grupos acilo para crear diferentes materiales de gomas que muestran diferentes propiedades físicas. En general, estas modificaciones genéticas han sido del tipo de alterar la composición final de la biogoma diana alterando en último término la expresión génica dentro del organismo hospedante, o aumentar el rendimiento de la biogoma diana mediante la introducción de un plásmido que muestra solo una amplificación de genes (tal como en las patentes de EEUU n.os 5.854.34, 5.985.623, y 6.284.516, de Pollock et al., y la patente de EEUU n.° 6.79.845, de Pollock).

La goma de diutano (también conocida como heterpolisacárido S-657) se prepara mediante la fermentación de la cepa de Sphingomonas sp. ATCC 53159, y muestra propiedades espesantes, suspensoras y estabilizantes en disoluciones acuosas. El diutano en general presenta una unidad repetida hexámera que consiste en cuatro azúcares en el esqueleto (glucosa-ácido glucurónico-glucosa-ramnosa) y una cadena lateral de dos restos ramnosa unidos a uno de los restos glucosa. Los detalles de la estructura de la goma de diutano pueden encontrarse en un artículo por Chowdhury, T. A., B. Lindberg, U. Lindquist y J. Baird, Carbohydrate Research, 164 (1987), 117-122. Se ha demostrado que el diutano tiene dos sustituyentes acetilo por unidad repetida en Diltz et al., Carbohydrate Research, 331 (21), 265-27. Ambas referencias se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los detalles para preparar la goma de diutano pueden encontrarse en la patente de EEUU n.° 5.175.278, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El diutano puede producirse a partir de la cepa de Sphingomonas utilizando técnicas de fermentación convencionales, tales como empleando fuentes de carbohidratos (glucosa, maltosa y similares, como ejemplos no limitantes), una fuente de nitrógeno, y sales adicionales.

Las características físicas impartidas por dicha biogoma de diutano en su forma salvaje son deseadas por ciertas industrias, en particular en términos de sus propiedades de modificación de la viscosidad y/o características de retención del agua. Por desgracia, el diutano ha demostrado ser difícil de producir de forma barata. Además, estos problemas de coste repercuten en contra de la utilización generalizada del diutano en la actualidad, puesto que el grado de viscosidad que muestra esta biogoma es insuficiente para suplantar a otras biogomas menos caras pero

eficaces (tales como la goma de xantano, como un ejemplo). Así, una necesidad establecida ha sido proporcionar un método para producir este diutano eficaz a un coste menor, como mínimo, y/o proporcionar una manera de producir una biogoma del tipo del diutano que también muestre una mejora significativa en las propiedades físicas. Hasta la fecha, la única mención de la producción de cualquier tipo de esfinganos relacionados (sin demostración para el diutano específicamente) se ha producido en términos de un mayor rendimiento (en las patentes de Pollock et al. mencionadas anteriormente). No se han realizado análisis ni sugerencias aceptables de ningún tipo para proporcionar un método para producir una goma de diutano mejorada con mayor peso molecular que muestre alguna mejora en las mediciones de la viscosidad a través de dicho método de producción.

Breve descripción de la invención

Ahora se ha sabido que la amplificación de ciertas secuencias de ADN aisladas nuevas para la biosíntesis del diutano dentro de un organismo de Sphingomonas hospedante no solo permite una mayor producción de goma de diutano a partir de este, sino que produce una goma de diutano que muestra mayores propiedades de viscosidad. Esta secuencia de ADN nueva (que se introduce dentro de un organismo hospedante mediante cualquier método conocido, tal como, pero sin limitarse a un plásmido) proporciona así los resultados deseados que se han buscado para los métodos de síntesis del diutano. Una ventaja diferenciada de la utilización de estos genes amplificados en un plásmido es la naturaleza relativamente sencilla de la incorporación de dicha secuencia de ADN aislada a los procedimientos de síntesis de diutano. Otra ventaja es la capacidad para producir estas propiedades de mayor viscosidad para la goma de diutano diana, mientras que se aumenta potencialmente la eficacia de producción de la fermentación, si es necesario.

Por consiguiente, esta invención incluye una goma de diutano que muestra una mejora en una serie de diferentes mediciones de la viscosidad, tal como se reivindica en la reivindicación 1. Entre estas se encuentran: i) una viscosidad intrínseca mayor que 15, preferiblemente mayor que 155, más preferiblemente mayor que 16 dl/g; ii) una viscosidad en agua salada 3 rpm mayor que 35, preferiblemente mayor que 37, más preferiblemente mayor que 4, y lo más preferiblemente mayor que 42 de lectura del dial; iii) una viscosidad en agua salada ,3 rpm mayor que 35,, preferiblemente mayor que 39., más preferiblemente mayor que 4., y lo más preferiblemente mayor que 41. centipoise (cP); y una viscosidad de baja velocidad de cizallamiento PEG mayor que 35, preferiblemente mayor que 37, más preferiblemente... [Seguir leyendo]

1.- Una goma de diutano que muestra una viscosidad intrínseca mayor que 15 decilitros/gramo cuando la viscosidad intrínseca se obtiene representando gráficamente la viscosidad reducida frente a la concentración de la disolución, y extrapolando una regresión lineal de los datos hasta la concentración cero,

y que muestra una viscosidad en agua salada 3 rpm mayor o igual a 42 de la lectura del dial, cuando la lectura se toma combinando la goma de muestra con agua salada sintética y mezclando, después enfriando la disolución hasta aproximadamente 26 °C y colocándola en una plataforma de muestras Fann, en donde la velocidad se ajusta a 3 rpm y se realiza la lectura del dial; y

en la que la goma de diutano se fabrica empleando Sphingomonas cepa ATCC n.° 53159 que comprende un 1 plásmldo que comprende una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO:1.

2 - La goma de diutano de la reivindicación 1 que muestra una viscosidad en agua salada ,3 rpm mayor que 35. cp cuando la lectura se toma empleando un viscosímetro Brookfield con un huso LV-2C para medir la viscosidad, ajustándose la velocidad del huso a ,3 rpm, y dejando rotar el huso durante al menos 6 minutos antes de registrar la viscosidad.

3.- La goma de diutano de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que muestra una viscosidad de baja velocidad de

cizallamiento en presencia del dispersante polietilenglicol que es mayor que 35 cp cuando la medición de la viscosidad se toma midiendo la viscosidad de una disolución al ,25% de la biogoma en agua de grifo convencional ("Standard Tap Water", STW) empleando un viscosímetro Brookfield LV equipado con un muelle de par de torsión 2,5+ a 3 rpm utilizando el huso LV 1 después de dejar que el huso rote durante 3 minutos.

4 - Un método para producir la goma de diutano de la reivindicación 1, que comprende introducir un plásmido que

comprende una secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO:1 en un organismo hospedante productor de diutano de Sphingomonas de la cepa ATCC n.° 53159, y cultivar el organismo hospedante bajo condiciones de fermentación.

- Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuecia de ácido nucleico según SEQ ID NO:1.