Evaluación del riesgo potencial de alteración del estado de ánimo y suicidio inducidos farmacológicamente: utilización de una plataforma dedicada.

Método in vitro para la determinación de la toxicidad o los efectos secundarios potenciales de un compuesto de ensayo después de su administración en un paciente,

que comprende las etapas siguientes:

a) obtener una muestra biológica que contiene células de mamífero, en el que dichas células de mamífero son estirpes celulares de origen humano que presentan una expresión regular y constitutiva de los enzimas de edición ADAR1a, ADAR1b y ADAR2 y del receptor de serotonina 2C (5HTR2C);

b) poner en contacto dichas células de mamífero con el compuesto que debe someterse a ensayo;

c) determinar en el mismo extracto celular:

- el perfil de edición que proporciona la proporción media de cada isoforma identificada del ARNm de 5-HT2CR medido en el extracto celular de ARN, y

- la expresión cuantitativa de dichos enzimas de edición ADAR1a, ADAR1b y ADAR2;

d) comparar los resultados obtenidos en la etapa c) entre dichas células tratadas con el compuesto que debe someterse a ensayo y las células de control no tratadas,

en el que en la etapa a) dichas células de mamífero proceden de la estirpe celular de neuroblastoma humano SHSY5Y.

Evaluación del riesgo potencial de alteración del estado de ánimo y suicidio inducidos farmacológicamente: utilización de una plataforma dedicada.

La presente invención se refiere a métodos in vitro para la determinación de la toxicidad potencial de compuestos de ensayo. La invención comprende además métodos in vitro para la selección de compuestos terapéuticos útiles para el tratamiento de patologías relacionadas con la alteración del mecanismo de edición del ARNm dependiente de ADAR A a I del receptor de serotonina 2C (5HTR2C). Finalmente, la presente invención se refiere a los kits y herramientas para la implementación de dichos métodos. La invención resulta de especial utilidad en la industria farmacéutica para el análisis del perfil de toxicidad o para el cribado de compuestos en el desarrollo de fármacos y/o de composiciones farmacéuticas.

La toxicidad es el motivo principal para abandonar moléculas terapéuticas candidatas durante el desarrollo preclínico y clínico. Según los conocimientos de los presentes inventores, actualmente existe una necesidad de proporcionar ensayos con los que determinar rápidamente el perfil de toxicidad de un compuesto en el ser humano. En general, estos ensayos son largos y costosos y sólo resultan parcialmente satisfactorios. Por ejemplo, la toxicidad animal está lejos de ser un reflejo de la toxicidad en el ser humano. Además, el reducido número de pacientes incluidos en los ensayos clínicos no permite identificar sistemáticamente las toxicidades asociadas a una población específica de pequeño tamaño. El desarrollo, perfeccionamiento y utilización de dichos ensayos debería permitir la identificación y eliminación de los compuestos tóxicos del procedimiento de desarrollo tan pronto como resulte posible en el procedimiento. De esta manera, los nuevos fármacos podrían comercializarse antes y a un menor coste para las compañías farmacéuticas y, a su vez, para las organizaciones de cuidado de la salud y para el consumidor. Además, dichos ensayos también podrían permitir la detección de algunas toxicidades que actualmente salen a la luz sólo durante el periodo posterior a la comercialización.

Los estudios de asociación genética, ratones con inactivaciones génicas y análisis post-mortem han sugerido la participación del receptor de serotonina 2C (HTR2C) en trastornos neuropsiquiátricos. En primer lugar un polimorfismo alélico funcional (Cys23Ser) de HTR2C se asocia a depresión y trastorno bipolar (Lerer et al., Mol. Psychiatry 6:579-585, 21). En segundo lugar, los ratones que no presentan receptor de serotonina 5-HT2C manifiestan convulsiones espontáneas, alteraciones cognitivas y un control anormal de la conducta alimentaria (Tecott et al., Nature 374:542-546, 1995). Estos animales también son hipersensibles al estrés repetido (Chougreen et al., Physiol. Behav. 79:217-226, 23). En tercer lugar, en cerebros post-mortem de pacientes afectados por trastorno bipolar o esquizofrenia, la expresión de ARN del receptor de serotonina 5-HT2C se encuentra regulado negativamente (Iwamoto et al., Mol. Psychiatry 9:46-416, 24; Castensson et al., Biol. Psychiatry 54:1212-1221, 23). También se cree que la edición del ARN de HTR2C participa en la fisiopatología de los trastornos mentales y la acción de los antidepresivos (Seeburg, Neuron 35:17-2, 22). Se editan cinco residuos de adenosina (denominados A, B, C, D y E o C') en una región codificante del segundo bucle intracelular del receptor de serotonina 5-HT2C y pueden conducir a sustituciones de aminoácidos en tres posiciones diferentes de la secuencia del receptor. La sustitución combinatoria! de estos residuos amino genera hasta 24 isoformas de la proteína HTR2C con diferentes eficiencias de acoplamiento a G (Price et al., J. Biol. Chem. 276:44663-44668, 21). En ratones, en comparación con las cepas endogámicas C57BL/6 y 129sv, la cepa BALB/c muestra un patrón de edición del pre- ARNm de 5-HT2C neocortical del cerebro frontal basal diferente que podría subyacer a su diferencia de reactividad frente al estrés. Además, los ratones BALB/c muestran cambios inducidos por estrés en la edición del pre-ARNm de 5-HT2C que son similares a los detectados en cerebros de víctimas de suicidio deprimidas (Englander et al., J. Neurosci. 25:648-651, 25). De hecho, en cerebros post-mortem, se ha informado de la edición alterada del ARN de HTR2C en pacientes con esquizofrenia, depresión y aquellos que habían cometido suicidio (Niswender et al., Neuropsychopharmacology 24:478-491, 21; Sodhi et al., Mol. Psychiatry 6:373-379, 21; Gurevich et al., Neuron 34:349-356, 22; Dracheva S. et al., Molecular Psychiatry 13:111-1, 28). Además, el interferón-a se utiliza en el tratamiento de la hepatitis C pero los síntomas de depresión con frecuencia aparecen como un efecto secundario de esta molécula en los pacientes y Yang et al. han demostrado que esta molécula altera fuertemente la edición del receptor 5HT2C (ver ref. en Tohda et al., J. Pharmacol. Sci. 1:427-432, 26).

Algunos estudios anteriores han demostrado que el receptor de serotonina 5-HT2C se expresa principalmente en el cerebro, particularmente en el plexo coroide, córtex prefrontal, áreas límbicas, ganglios básales e hipotálamo (Tohda et al., Neurosci. Res. 24:189-193, 1996; Julius et al., 241:558-564, 1988; Pasqualetti et al., Neuroscience 92:61- 611, 1999). Este patrón específicamente cerebral de expresión restringe las investigaciones de las asociaciones potenciales existentes entre la edición del ARN de HTR2C y el estado psiquiátrico a estudios post-mortem.

Recientemente se ha desarrollado un nuevo método que permite cuantificar a partir del ARN total de tejidos el perfil de edición completo de 5-HT2CR en un único ensayo (Poyau et al., Electrophoresis 28:2843-52, 27). El ensayo determina el porcentaje de cada ¡soforma editada y no editada en la fracción de ARNm específico contenido en la muestra de tejido. Se adapta muy bien a la evaluación de variaciones de la edición en reglones cerebrales específicas en el ratón, la rata y el ser humano. Este tipo de tecnología ha tenido éxito en el análisis del perfil de edición en células neurales en cultivo primario (Chanrlon B. et al., Molecular Pharmacol. 73:748-57, 28).

El interés principal de los inventores de dicha evaluación es que permite extraer del perfil un índice de actividad de los ¡soenzimas de edición ADAR 1a, 1b, ADAR2, ya que los isoenzimas ADAR1 editan los sitios A, B y también C y E y ADAR2 puede editar los sitios D, C y E. De esta manera, de hecho, se admite que una isoforma en la que los sitios A y/o B han sido editados, que ha sido transformada por los isoenzimas ADAR1, los cuales actúan solos en el caso de que el sitio D no sea editado (¡soformas editadas: A, AB, ABC, ABCE, ABE, AC, ACE, AE, B, BC, BCE, BE) o que actúan conjuntamente con ADAR2 en el caso de que las isoformas presenten también el sitio D editado (isoformas editadas: ABCD, ABCDE, ABD, ABDE, ACD, ACDE, AD, ADE, BCD, BCDE, BD, BDE, C, CE, E).

Las isoformas en las que los sitios A y/o B no se han editado y el sitio D se ha editado se consideran el resultado de

la acción de sólo ADAR2.

Conjuntamente con dicho análisis del perfil de edición completo de 5-HT2CR, los inventores han demostrado que una evaluación de la expresión de los Isoenzimas ADAR como enfoque complementario resulta particularmente adecuada para la evaluación del contexto general de edición de la desregulación de la maquinaria de edición. Incluye el análisis cuantitativo y cualitativo de la expresión de los isoenzimas ADAR (ARNm, es decir, RT-PCR cuantitativa y/o a partir de la proteína codificada correspondiente, es decir, mediante transferencia western).

Considerando la advertencia especial de la Food and Drug Administration (FDA) sobre el riesgo de suicidio respecto a fármacos antiepilépticos, antldepreslvos y antipsicóticos, por ejemplo, recientemente se ha encontrado que el fármaco para la pérdida de peso Acomplla (rimonabant) induce un comportamiento suicida y otros efectos secundarios psicológicos en algunos pacientes, dificultando estos conocidos efectos secundarios neuropsiquiátricos que la FDA y la Agencia Europea del Medicamento aprecien una relación riesgo-beneficio positiva para este nuevo fármaco y motivando que finalmente recomienden su retirada del mercado debido a sus efectos secundarios.

Tal como se ha indicado anteriormente, existe una necesidad de proporcionar ensayos que puedan determinar rápidamente la toxicidad o el perfil de potenciales efectos secundarios de un fármaco en el ser humano, particularmente antes del periodo que sigue a la comercialización.

Por dicho motivo los Inventores han decidido desarrollar una plataforma dedicada que podría proponerse para... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para la determinación de la toxicidad o los efectos secundarios potenciales de un compuesto de ensayo después de su administración en un paciente, que comprende las etapas siguientes:

a) obtener una muestra biológica que contiene células de mamífero, en el que dichas células de mamífero son estirpes celulares de origen humano que presentan una expresión regular y constitutiva de los enzimas de edición ADAR1 a, ADAR1 b y ADAR2 y del receptor de serotonina 2C (5HTR2C);

b) poner en contacto dichas células de mamífero con el compuesto que debe someterse a ensayo;

c) determinar en el mismo extracto celular:

- el perfil de edición que proporciona la proporción media de cada isoforma identificada del ARNm de 5-HT2CR medido en el extracto celular de ARN, y

- la expresión cuantitativa de dichos enzimas de edición ADARIa, ADARIb y ADAR2;

d) comparar los resultados obtenidos en la etapa c) entre dichas células tratadas con el compuesto que debe someterse a ensayo y las células de control no tratadas,

en el que en la etapa a) dichas células de mamífero proceden de la estirpe celular de neuroblastoma humano SH- SY5Y.

2. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa c), se determina la expresión cuantitativa de dichos enzimas de edición ADARIa, ADARIb y ADAR2, mediante la medición de la expresión de ARNm de dichos enzimas de edición o mediante la medición de las proteínas enzimáticas de edición expresadas en el extracto celular.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que en la etapa c), el perfil de edición de cada isoforma identificada del ARNm de 5-HT2CR y la expresión de ARNm cuantitativa de dichos enzimas de edición, ADARIa, ADARIb y ADAR2, determinados en el mismo extracto celular, se determinan en el mismo extracto celular de ARN total.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa c), el análisis de los resultados de la determinación del perfil de edición permiten obtener los índices de actividad de estos enzimas de edición, ADARIa, ADARIb y ADAR2.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la toxicidad o los efectos secundarios potenciales de dicho compuesto de ensayo después de su administración en un paciente se seleccionan de entre el grupo que consiste en trastornos mentales, esquizofrenia, depresión, suicidio por depresión o conducta alimentaria anormal.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa c), el perfil de edición que proporciona la proporción media de cada isoforma identificada del ARNm de 5-HT2CR medido en el extracto de ARN celular se mide mediante un método CE-SSCP que implica una PCR de tipo anidado que comprende dos rondas de PCR, y en el que la primera ronda de PCR se lleva a cabo con los conjuntos de cebadores siguientes:

para las estirpes celulares humanas:

directo: 5'-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3', inverso: 5'-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3'; y

en el que la segunda ronda de PCR se lleva a cabo con los conjuntos de cebadores siguientes:

para las estirpes celulares humanas:

directo: 5'-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3', inverso: 5'-GCAAT CTT CAT GAT GGCCTTA-3'.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en la etapa c), el par de cebadores específicos para la amplificación por PCR del ARNm de ADAR se seleccionan de entre el grupo que consiste en:

- para la amplificación del ARNm de la isoforma ADAR1-15 humana:

d i recto: 5'-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-3' i nverso: 5'-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-3'

- para la amplificación del ARNm de la ¡soforma ADAR1-11 humana:

directo: 5'-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3' inverso: 5'-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-3'

- para la amplificación del ARNm de ADAR2 humano:

directo: 5'-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-3' inverso: 5'-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-3'

8. Kit para la determinación de la toxicidad o los efectos secundarios potenciales de un compuesto de ensayo después de su administración en un paciente, comprendiendo dicho kit:

a) unas células de mamífero de una estirpe celular de origen humano en el que dichas células presentan una expresión regular y constitutiva de los enzimas de edición ADARIa, ADARIb y ADAR2 y del receptor de serotonina 2C (5HTR2C); y

b) dos conjuntos de cebadores para medir mediante una PCR cuantitativa (Q) que implica una PCR de tipo anidado que comprende dos rondas de PCR cada isoforma del ARNm de 5-HT2CR que puede encontrarse presente en un extracto de ARN de dichas células de mamífero; y

c) un conjunto de cebadores para medir mediante una Q-PCR cuantitativa la expresión cuantitativa de los enzimas de edición ADARIa, ADARIb y ADAR2,

en el que en la etapa a), dichas células de mamífero proceden de la estirpe celular de neuroblastoma SH-SY5Y.