Epítopos antigénicos de la proteína reguladora del factor de virulencia en Staphylococcus aureus y sus mimótopos y uso.

Un epítopo antigénico de TRAP (objetivo de la proteína activadora de ARN III),

una proteína reguladora del factor de virulencia en Staphylococcus aureus, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.

Epítopos antigénicos de la proteína reguladora del factor de virulencia en Staphylococcus aureus y sus mimótopos y uso

Campo técnico 5

La presente invención se refiere epítopos antigénicos y mimótopos de los mismos, en particular, a dos epítopos antigénicos de TRAP (objetivo de la proteína activadora de ARN III) , una proteína reguladora del factor de virulencia en Staphylococcus aureus y sus mimótopos. La presente invención se refiere además al uso de polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a estos epítopos en la fabricación de una nueva vacuna o medicamento para 10 combatir contra la infección por Staphylococcus aureus.

Antecedentes del estado del arte

Staphylococcus aureus, una bacteria Gram positiva patógena común, es un microorganismo importante que causa 15 enfermedades mortales tales como infecciones por quemaduras y heridas de guerra, neumonía, endocarditis, septicemia, choque tóxico, etc. Hay millones de pacientes que sufren de infecciones causadas por Staphylococcus aureus sólo en hospitales cada año. En la actualidad, se utiliza principalmente una administración combinada de antibióticos para el tratamiento clínico de las infecciones causadas por Staphylococcus aureus, pero sus efectos terapéuticos siguen siendo insatisfactorios. Ya que Staphylococcus aureus puede fácilmente desarrollar resistencia a los 20 medicamentos y no existe una buena solución, muchos antibióticos comunes son ineficaces, por lo que el control de la infección por Staphylococcus aureus es uno de los problemas más urgentes que hay que resolver en la medicina clínica.

Las principales sustancias patógenas de Staphylococcus aureus son toxinas, incluyendo hematoxina, leucocidina, enterotoxina, etc. Las investigaciones recientes indican que la síntesis de estos factores de virulencia en 25 Staphylococcus aureus está controlada por una molécula de ARN regulable y ARN III. ARN III activa la transcripción génica de factores de virulencia, y regula la traducción de factores de virulencia por complementariedad de bases. El nivel de ARN III es relativamente bajo durante la fase logarítmica temprana de crecimiento bacteriano, pero aumenta 40 veces durante la fase logarítmica tardía de crecimiento bacteriano, mientras que el nivel de ARN III está regulado por la proteína RAP (proteína activadora de ARN III) secretada por la misma Staphylococcus aureus, por lo que RAP también 30 se denomina como el factor estimulador de virulencia de Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus continuamente secreta RAP, y RAP activa la producción de factores de virulencia sólo cuando RAP alcanza una cierta concentración. Staphylococcus aureus sin la producción de RAP no causa enfermedades. Las investigaciones recientes muestran que RAP activa la transcripción de ARN III a través de la mediación de una proteína TRAP de 21 KD (objetivo de la proteína activadora de ARN III) . Cuando el gen que codifica la TRAP es inactivado por mutación, RAP no puede activar la 35 transcripción de ARN III. TRAP consta de 167 aminoácidos y tiene actividad de His quinasa. TRAP es fosforilada durante la fase temprana del crecimiento de Staphylococcus aureus, y alcanza el nivel máximo durante la metafase de crecimiento logarítmico. Después de la acción de RAP, la transducción de la señal se realiza mediante autofosforilación. Aumenta el nivel intracelular de ARN III, y acelera la secreción de exotoxinas de Staphylococcus aureus (Naomi B, et al, . J. Biol, Chem, 2001, 276: 2658-2667) . Se puede observar que TRAP desempeña un papel crítico en la regulación de 40 la expresión de la toxina en Staphylococcus aureus. Las investigaciones en 2001 indican que los anticuerpos contra TRAP pueden reducir eficazmente la secreción de exotoxinas de Staphylococcus aureus (Oleny V, et al., Péptidos 2001, 22: 1621-1627) .

Como estructuras objetivo reconocidas por las células inmunes y base de la sustancia para la activación de la respuesta 45 inmune específica, los epítopos antigénicos son importantes para los estudios sobre las respuestas inmunes. Con la aplicación de la mutación por supresión del antígeno, pepscan, difracción cristalina de rayos X, etc., es posible determinar "epítopos antigénicos". Sin embargo, estos métodos son costosos, y necesitan una gran cantidad de trabajo manual y de recursos de materiales. Además, no son adecuados para el estudio de epítopos complejos. Por lo tanto sus aplicaciones son limitadas. El concepto de "mimótopo" no sólo proporciona una pista para el análisis del epítopo 50 antigénico, sino que también presenta una nueva forma para el desarrollo de una vacuna. Un mimótopo usualmente representa una estructura polipeptídica que puede imitar un epítopo antigénico y tiene una reactionogenicidad similar a la de antígeno nativo. Cuando el mimótopo se conjuga con un portador adecuado, puede presentar una inmunogenicidad similar (el antígeno nativo puede no comprender una secuencia o estructura espacial idéntica o similar) . Los estudios de algunos antígenos que son difíciles de ser obtenidos o identificados apenas pueden llevarse a 55 cabo, debido a que sus epítopos antigénicos difícilmente pueden ser determinados, pero este problema se puede resolver mediante la obtención de sus mimótopos. El mimótopo proporciona una pista para el análisis del epítopo antigénico y proporciona una nueva ruta para el desarrollo de la vacuna, además, promueve las investigaciones de los epítopos conformacionales y epítopos antigénicos no proteicos.

Una de las técnicas críticas para el estudio de mimótopos es la técnica de despliegue en fagos que fue establecida por el Dr. Smith en 1985. La construcción de la biblioteca de péptidos de despliegue en fagos se lleva a cabo mediante la técnica de despliegue en fagos, que comprende el despliegue de péptidos exógenos dispuestos en forma aleatoria (que por lo general consiste de 6-15 residuos de aminoácidos) en la superficie del fago para formar una biblioteca de péptidos al azar que tiene una diversidad de más de 107. A través de un procedimiento de paneo biológico de 65 purificación por afinidad, se seleccionan los péptidos que se enlazan a una molécula objetivo (tal como un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, etc.) a partir de la biblioteca de péptidos de fagos, luego estos péptidos de enlazamiento se comparan con el antígeno nativo, en donde algunos tienen una alta homología con el antígeno nativo y algunos son completamente diferentes del antígeno nativo, pero todos ellos tienen antigenicidad e inmunogenicidad similares con el antígeno nativo, y estos péptidos de enlazamiento se denominan "mimótopos". En comparación con los métodos convencionales de análisis de epítopos antigénicos, la técnica de despliegue en fagos tiene el mérito de un 5 funcionamiento sencillo y rápido y amplias aplicaciones. Es adecuado para el estudio de epítopos conformacionales, epítopos antigénicos no proteicos y antígenos no identificados (Zhong G, et al., J Biol Chem, 1994, 269: 24183 - 24188; Mottic et al., Gene 1994, 146: 191-198; . Rodríguez L, et al., J Gen Virol 1999, 80 (Pt3) : 727-738) .

El procedimiento de selección para la utilización del anticuerpo policlonal o antisuero es difícil en comparación con el 10 anticuerpo monoclonal, pero obviamente tiene ventajas. En primer lugar, se puede obtener fácilmente el objetivo, y se necesita poco tiempo, es de bajo coste y operación sencilla en comparación con la preparación del anticuerpo monoclonal; en segundo lugar, se pueden obtener mimótopos de varios epítopos antigénicos, por lo tanto la eficiencia de selección es alta, lo que facilita la preparación de la vacuna compuesta con una fuerte inmunogenicidad. En la presente invención, el antisuero se purifica por cromatografía de afinidad inmune para remover los anticuerpos no 15 específicos y obtener moléculas con alta especificidad, por lo tanto se pueden seleccionar clones de fagos específicos y se puede reducir el enriquecimiento de clones no específicos.

Contenidos de la invención 20

El objetivo de la presente invención es proporcionar dos epítopos antigénicos y mimótopos de TRAP (Objetivo de la proteína activadora de ARN III) , una proteína reguladora del factor de virulencia de Staphylococcus aureus.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de dichos epítopos o polipéptidos consistente con dichos epítopos en secuencias de aminoácidos en la fabricación de una vacuna o medicamento para combatir contra las 25 infecciones de Staphylococcus aureus.

Para cumplir con el primer objetivo de la presente invención, el anticuerpo policlonal TRAP se utiliza como objetivo para seleccionar mimótopos antigénicos de dos grupos de TRAP a partir... [Seguir leyendo]

1. Un epítopo antigénico de TRAP (objetivo de la proteína activadora de ARN III) , una proteína reguladora del factor de virulencia en Staphylococcus aureus, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias. 5

2. Un epítopo antigénico de TRAP (objetivo de la proteína activadora de ARN III) , una proteína reguladora del factor de virulencia en Staphylococcus aureus, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2.

3. Un mimótopo de TRAP, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula:

XPXHHQHXTGFT

en donde X representa cualquier aminoácido seleccionado de 21 residuos de aminoácidos conocidos de tipo L de origen 15 natural o isómeros D de los mismos.

4. Un mimótopo de TRAP de acuerdo con la reivindicación, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula:

SWFDXXLYPXXX

en donde X representa cualquier aminoácido seleccionado de 21 residuos de aminoácidos conocidos de tipo L de origen natural o isómeros D de los mismos.

5. Un mimótopo de TRAP, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos resultante del reemplazo de un aminoácido en la secuencia expuesta en las reivindicaciones 1 o 2 con base en la similitud entre los aminoácidos, comprendiendo dicho reemplazo uno o más de:

a) el reemplazo del residuo de glutamina (Q) , el residuos de glutamato (E) , el residuo de aspartato (D) y el residuo de 30 asparagina (E) entre sí;

b) el reemplazo del residuo de triptófano (W) , el residuo de tirosina (Y) y el residuo de fenilalanina (F) entre sí;

c) el reemplazo del residuo de lisina (K) y el residuo de arginina (R) entre sí;

d) el reemplazo del residuo de serina (S) y el residuo de treonina (T) entre sí;

e) el reemplazo del residuo de alanina (A) y el residuo de glicina (G) entre sí; 35

f) el reemplazo del residuo de leucina (L) y el residuo de metionina (M) entre sí.

6. Un mimótopo de TRAP, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos resultante del reemplazo de un aminoácido en la secuencia expuesta en las reivindicaciones 3 o 4 con base en la similitud entre los aminoácidos, comprendiendo dicho reemplazo uno o más de: 40

a) el reemplazo del residuo de glutamina (Q) , el residuo de glutamato (E) , el residuo de aspartato (D) y el residuo de asparagina (E) entre sí;

b) el reemplazo del residuo de triptófano (W) , el residuo de tirosina (Y) y el residuo de fenilalanina (F) entre sí;

c) el reemplazo del residuo de lisina (K) y el residuo de arginina (R) entre sí; 45

d) el reemplazo del residuo de serina (S) y el residuo de treonina (T) entre sí;

e) el reemplazo del residuo de alanina (A) y el residuo de glicina (G) entre sí;

f) el reemplazo del residuo de leucina (L) y el residuo de metionina (M) entre sí.

7. El uso de un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias expuestas en las reivindicaciones 1 a 6 en 50 cualquier forma para la preparación de un medicamento o vacuna contra las infecciones por Staphylococcus aureus.