Enzimas celulasas optimizadas.

Un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con respecto a la SEQ ID NO:

2, en donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado por sustitución o supresión.

Enzimas celulasas optimizadas Campo del invento

El invento divulga unas enzimas celulasas con unas propiedades optimizadas para el tratamiento de unos substratos, que contienen celulosas y lignocelulosas. En particular, se divulgan unas enzimas celobiohidrolasas con unas características preferidas. La presente divulgación proporciona unas variantes de fusión, inserción, supresión (deleción) y/o sustitución de tales enzimas. Las variantes de enzimas tienen unas elevadas propiedades de estabilidad térmica, estabilidad proteolítica, actividad específica y/o una estabilidad frente a un pH extremo. Se divulgan unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales enzimas, una composición que comprende tales enzimas, un método para su producción, y el uso para el tratamiento de una celulosa y/o para la producción de combustibles biológicos.

Antecedentes del invento

El desarrollo de unos procedimientos de producción basados en materias primas renovables es muy deseado, por ejemplo, para la producción de etanol a partir de materiales celulósicos y lignocelulósicos.

Un material celulósico en una forma pura o en combinación con una hemicelulosa y/o una lignina es una materia prima valiosa y que está fácilmente disponible para la producción de productos químicos y combustibles. Una etapa clave en el tratamiento de una celulosa y una lignocelulosa es la hidrólisis de la celulosa, que es un polímero de glucosa con enlaces beta-1,4, y la subsiguiente liberación de los monómeros de glucosa y de unos cortos oligómeros de glucosa tales como una celobiosa, una celotriosa, etc. Unas enzimas que catalizan esta reacción son encontradas en diversos organismos, especialmente en ciertos hongos filamentosos y en ciertas bacterias, que son capaces de degradar e hidrolizar a una celulosa.

Son conocidos unos procedimientos continuos para convertir a una biomasa lignocelulósica sólida en unos productos carburantes combustibles. Un tratamiento para hacera los substratos celulósicos más susceptibles frente a una degradación enzimática comprende una molienda, un tratamiento químico y/o un tratamiento hidrotérmico. Unos ejemplos de éstos son una oxidación en húmedo y/o un reventamiento con vapor. Tales tratamientos aumentan la accesibilidad de las fibras de celulosa y las separan con respecto de una hemicelulosa y una lignina, lo que es requerido para la degradación de los polímeros de celulosa. Entre éstas, unas enzimas celobiohidrolasas (CBH), y más específicamente una celobiohidrolasa I (CBHI) desempeñan un cometido especial en la etapa de hidrólisis y proporcionan la actividad enzimática más favorable para el procedimiento. Las enzimas CBHI catalizan la liberación hidrolítica progresiva de celobiosa desde el extremo reductor de los polímeros de celulosa (Lynd LR, Weimer PJ, van Zyl WH, Pretorius IS. Microbial cellulose utilization: fundamentáis and biotechnology [Utilización de la celulosa por microbios: fundamentos y biotecnología]. Microbiol Mol Biol Rev. 2002 Sep;66(3):506-77).

Unos materiales celulósicos hidrolizados contienen diversas y valiosas moléculas de hidratos de carbono, que pueden ser aisladas a partir de las mezclas. Unos materiales hidrolizados de materiales celulósicos, que contienen azúcares, pueden ser utilizados para una producción microbiana de una variedad de productos químicos finos o biopolímeros, tales como unos ácidos orgánicos, etanol o unos alcoholes superiores (es decir unos dioles o polioles) o unos poli(hidroxialcanoatos) (PHAs). Uno de los usos principales de los materiales hidrolizados de azúcares se encuentra en la producción de combustibles biológicos.

Kurabi y colaboradores (2005) describen unos preparados de celulasas procedentes de Trichoderma reesei y de otros hongos, tales como Penicillium sp. El rendimiento se ha analizado en abetos Douglas, que habían sido reventados con vapor y tratados previamente con un disolvente orgánico de etanol. Un mejor rendimiento de unas mezclas de enzimas parece ser el resultado de las propiedades mejoradas de unos componentes individuales de enzimas así como del efecto de cada compuesto en la mezcla, especialmente la presencia de una beta-glucosidasa (Kurabi A, Berlin A, Gilkes N, Kilburn D, Bura R, Robinson J, Markov A, Skomarovsky A, Gusakov A, Okunev O, Sinitsyn A, Gregg D, Xie D, Saddler J.(2005) Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv- pretreated Douglas-Fir by novel and commercial fungal cellulases [Hidrólisis enzimática de abetos de Douglas reventados con vapor y tratados previamente con un disolvente orgánico de etanol mediante unas celulasas fúngicas y adquiribles comercialmente]. Appl Biochem Biotechnol. 121-124: 219-30).

Unas secuencias de celobiohidrolasas de la clase de una glucohidrolasa 7 (cel7) son conocidas en la especialidad a partir de varias fuentes fúngicas. Una celobiohidrolasa Cel7 de Talaromayces emersonii es conocida y ya se ha informado acerca de su expresión en Escherichia coli. Grassicky colaboradores han presentado un informe sobre la purificación y la determinación de la estructura en 3D de una proteína CBH de núcleo natural, y de la clonación y sobreexpresión de los correspondientes genes, procedentes de una fuente fúngica termófila. Se encontró que una CBH 16 es extremadamente estable térmicamente con un valor óptimo de la temperatura de 68 °C a pH 5,0 y un

período de tiempo de vida media (t1/2) de 68,0 min a 80 °C y un pH de 5,0. (Grassick A, Murray PG, Thompson R, Collins CM, Byrnes L, Birrane G, Higgins TM, Tuohy MG. Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the fllamentous fungus, Talaromyces emersonii [Estructura tridimensional de una celobiohidrolasa natural termoestable, CBH IB, y caracterización molecular del gen cel7 del hongo filamentoso, Talaromyces emersonii]. Eur J Biochem. 2004 Nov;271 (22):4495-4506) y en Saccharomyces cerevisiae (Voutilainen SP, Murray PG, Tuohy MG, Koivula A. Expression of Talaromyces emersonii cellobiohydrolase Cel7A in Saccharomyces cerevisiae and rational mutagenesis to improve its thermostability and activity (Expresión de una celobiohidrolasa de Talaromyces emersonii Cel7A en Saccharomyces cerevisiae y mutagénesis racional para mejorar su estabilidad térmica y su actividad], Protein Eng Des Sel. 2010 Feb;23(2):69-79), sin embargo, la proteína o bien era producida en una forma inactiva o en unos rendimientos bastante bajos (de menos que o iguales a 5 mg/l). Una celobiohidrolasa I de Hypocrea jecorina puede ser producida a partir de unas cepas de tipo silvestre (wt) o modificadas genéticamente del género Hypocrea o Trichoderma en unos altos rendimientos. Unas secuencias mejoradas de una Cel7A de Hypocrea jecorina han sido divulgadas en los documentos de patentes de los EE.UU. US7459299B2, US7452707B2, en los documentos de solicitudes de patentes internacionales W02005/030926, W001/04284A1 o en el documento de solicitud de patente de los EE.UU.: US2009/0162916 A1.

Unas posiciones que conducen a mejoramientos fueron deducidas a partir de unas alineaciones con unas secuencias procedentes de unas enzimas termoestables reseñadas, y que se han propuesto a partir de una información estructural y una barajadura de unas posiciones identificadas, seguida por unos escrutinios limitados. Se ha informado sobre un escrutinio de unas grandes bibliotecas en ciertos organismos transformables tales como Saccharomyces cerevisiae mediante el uso de unos substratos fluorescentes muy sensibles, que se asemejan a unos substratos naturales de un modo muy restrictivo. (Percival Zhang YH, Himmel ME, Mielenz JR. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies [Perspectivas del mejoramiento de celulasas: escrutinio y estrategias de selección], Biotechnol Adv. 2006 Sep-Oct;24(5):452-81).

Se ha Informado sobre la producción de unas celobiohidrolasas procedentes de otros sistemas fúngicos tales como los de Thermoascus aurantiacus, Chrysosporium lucknowense o Phanerochaete chrysosporium. Se ha informado sobre la expresión de una celobiohidrolasa Cel7 a partir de levaduras, pero los rendimientos enzimáticos o las propiedades enzlmáticas siguen siendo insatisfactorios/as. (Penttilá ME, André L, Lehtovaara P, Bailey M, Teeri TT, Knowles JK. Efflclent secretion oftwo fungal cellobiohydrolases by Saccharomyces cerevisiae [Secreción eficiente de dos celobiohidrolasas fúngicas por Saccharomyces cerevisiae]. Gene. 1988;63(1 ):103-12).

El documento W003/000941 divulga un cierto número de CBHs y sus correspondientes secuencias génicas. Sin embargo, no se divulgaron propiedades fisiológicas ni aplicaciones. Se ha informado de que la fusión de unos dominios de fijación de celulosa con unas subunidades catalíticas... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que tiene una actividad de celobiohidrolasa, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con respecto a la SEQ ID NO: 2, en

5 donde el residuo de aminoácido en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 se ha modificado por sustitución o supresión.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido conserva un 50 % de su máxima capacidad de conversión del substrato cuando la conversión se realiza durante 60 minutos a una temperatura de 60°C o más alta.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde este polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad entre secuencias de por lo menos 90 %, de manera preferida de por lo menos 95 %, de manera muy especialmente preferida de por lo menos 99 % con la SEQ ID NO: 2.

15 4. El polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de

aminoácidos del polipéptido tiene la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2, o una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en donde de 1 a 75 residuos de aminoácidos, de manera preferida más preferida de 1 a 35 residuos de aminoácidos, son sustituidos, suprimidos o insertados.

20 5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, en el que adicionalmente uno o más de los siguientes residuos

de aminoácidos de la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2 son modificados por sustitución o supresión: en las posiciones G4, A6, T15, Q28, W40, D64, E65, A72, S86, K92, V130, V152, Y155, K159, D181, E183, N194, D202, P224, T243, Y244, I277, K304, N310, S311, N318, D320, T335, T344, D346, Q349, A358, Y374, A375, T392, T393, D410, Y422, P442, N445, R446, T456, S460, P462, G463, H468 y/o V482 de los aminoácidos 1 hasta 500 de la 25 SEQ ID NO: 2.

6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polipéptido comprende uno o más de los siguientes intercambios preferidos con respecto a la secuencia definida por la SEQ ID NO: 2:

7. El polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos escogida entre la lista de las siguientes mutaciones de la SEQ ID NO: 2:

8. El polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, que es expresado y segregado dentro del material sobrenadante hasta un nivel de más que 100 mg/l, de manera más preferida de más que 200 mg/l, de manera especialmente preferida de más que 500 mg/l y de manera máximamente preferida de más que 1 g/l después de la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad entre secuencias de por lo menos 85 % con la SEQ ID NO: 2, dentro de una levadura, en donde el residuo de aminoácido situado en la posición Q1 de la SEQ ID NO: 2 tiene que ser modificado por sustitución o supresión.

9. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 hasta 8, que tiene de manera preferida una identidad de por lo menos 95 % con la SEQ ID NO: 1.

10. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Una célula anfitriona que ha sido transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 11, en donde esta célula anfitriona se deriva del conjunto que se compone de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Pichia, Hansenula, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Candida y Yarrowina.

13. Una composición que comprende el polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 hasta 9 y una o más endoglucanasas y/o una o más beta-glucosidasas y/o una o más otras celobiohidrolasas y/o una o más xilanasas.

14. Uso del polipéptido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 hasta 9 o de la composición de acuerdo con la reivindicación 13 para la degradación enzimática de una biomasa lignocelulósica, y/o para el tratamiento de materiales textiles y/o como un ingrediente en detergentes y/o como un ingrediente en alimentos o composiciones alimentarias.