Combinación de enzimas para licuar biomasa.

Procedimiento para la producción de un producto licuado, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar material de biomasa de remolacha azucarera y/o caña de azúcar;

(b) licuar dicha biomasa sometiéndola a una mezcla de enzimas que comprende celobiohidrolasa, betaglucosidasa y poligalacturonasa para dar un producto licuado con un contenido de sólidos insolubles restantes de menos del 2% (p/p).

Combinación de enzimas para licuar biomasa

Campo de la invención La invención se refiere a un material de biomasa de remolacha azucarera y/o caña de azúcar licuado así como a métodos de producción y usos del mismo.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

La remolacha azucarera (Beta vulgaris) y la caña de azúcar (Saccharum sp.) son fuentes valiosas de azúcar refinado tal como sacarosa líquida o cristalina para uso industrial y particular. Las raíces de la remolacha azucarera contienen sacarosa y pulpa de remolacha azucarera, conteniendo esta última pectina, celulosa y hemicelulosa. La caña de azúcar contiene sacarosa y pulpa de caña de azúcar, conteniendo esta última celulosa, hemicelulosa, pectinas y lignina. El procedimiento de refinado de azúcar es un procedimiento para extraer sacarosa de o bien remolacha azucarera o bien caña de azúcar seguido por la retirada de impurezas y la cristalización de sacarosa. Tras la retirada de barro, arena, malas hierbas y hojas, las remolachas azucareras se alimentan al interior de cortadoras y se cortan en trozos largos llamados cosetas. Las cosetas se descargan al interior de un tanque de escaldado que conduce al difusor. Aquí el azúcar se retira de las cosetas disolviéndose en agua caliente en un procedimiento a contracorriente continuo. Los productos de este procedimiento son la disolución azucarada llamada jugo crudo y la denominada pulpa de remolacha, secándose ésta última en una secadora de pulpa. El jugo crudo se mueve a través de diversas fases de purificación y filtración para retirar impurezas y sustancias no azucaradas para proporcionar jugo denso (contenido del 65-70% de s.s.) o, tras la cristalización, azúcar fino refinado. Además de refinarse para dar azúcar cristalino, la sacarosa en forma de azúcar crudo o jugo denso es un sustrato de fermentación valioso para la producción biotecnológica de productos químicos y biomoléculas. Debido al costoso procedimiento de refinería, el uso de sacarosa y otros azúcares como materias primas de fermentación para la producción de productos tales como combustibles o elementos estructurales de polímeros es relativamente caro. Por tanto, se desean sustratos de fermentación más económicos.

La biomasa de remolacha azucarera no puede usarse de manera eficaz para los procedimientos de fermentación típicos tales como producción de etanol, butanol, ácido láctico o ácido propiónico sin tratamiento adicional para licuar la biomasa e hidrolizar los polímeros.

Se han descrito procedimientos de tratamiento químico para la liberación de azúcares monoméricos y sacarosa de biomasa que contiene celulosa, pectina y hemicelulosa tales como biomasa de remolacha azucarera. Procedimientos no selectivos tales como tratamiento con ácido sulfúrico pueden usarse para hidrolizar biomasa de remolacha azucarera; sin embargo tal tratamiento no es eficaz a bajas temperaturas. A temperaturas más altas (por ejemplo pretratamiento de vapor de ácido diluido a 200-250ºC) conduce a componentes inhibidores tales como hidroximetilfurfural (HMF) o furfural que hace que un procedimiento de fermentación posterior sea problemático (Jing et al., 2009) .

El documento US 4.886.672 (Baynast et al.) describe un procedimiento para la licuación de biomasa de remolacha azucarera mediante tratamiento enzimático. El procedimiento incluye lavar y moler de manera gruesa biomasa de remolacha azucarera, mezclar el producto molido con una mezcla enzimática, ajustar el pH a de 3 a 5, 5, moler de manera fina adicionalmente el sustrato y recuperar el líquido resultante. La mezcla de enzimas usada en este procedimiento contiene al menos una “SPS-asa” (“SP 249”, una preparación de enzimas obtenida a partir de Aspergillus aculeatus) , una celulasa (“Celluclast”, una preparación de enzimas obtenida a partir de Trichoderma reesei) y una celobiasa (“Novo 188”, una preparación de enzimas obtenida a partir de Aspergillus niger) . En este procedimiento pueden añadirse agentes bacteriostáticos tales como formol. Aunque la adición de tales agentes bacteriostáticos no es deseable para procedimientos de fermentación posteriores que usan la biomasa licuada, su adición se describe como esencial para evitar proliferaciones microbianas, por ejemplo para proporcionar una biomasa estable en almacenamiento.

Sumario de la invención El objetivo subyacente de la presente invención es por tanto proporcionar un procedimiento para producir una biomasa que pueda usarse en un procedimiento de fermentación posterior incluso después de almacenamiento prolongado.

En un primer aspecto, la invención proporciona por tanto un procedimiento para la producción de una biomasa licuada, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar biomasa sólida derivada de remolacha azucarera y/o caña de azúcar;

(b) licuar dicha biomasa sometiéndola a una mezcla de enzimas que comprende actividad celobiohidrolasa,

beta-glucosidasa y poligalacturonasa para dar una biomasa licuada con un contenido de sólidos insolubles restantes de menos del 2% (p/p) .

En una realización preferida de la invención, se añade un producto químico o microorganismo para hacer que la biomasa licuada sea estable en almacenamiento.

En una realización particularmente preferida de la invención, se añade el producto químico o microorganismo antes de o durante la etapa (b) .

El producto químico es preferiblemente un ácido que se añade en una cantidad para ajustar el pH de la biomasa licuada a un pH inferior a 3.

La invención también proporciona una biomasa licuada derivada de remolacha azucarera y/o caña de azúcar, que es estable en almacenamiento y fermentable, y que puede obtenerse mediante el procedimiento de la presente invención. Esta biomasa licuada puede usarse para la producción de un producto que resulta de fermentación.

En otro aspecto, la invención proporciona por tanto un procedimiento para la producción de una biomasa licuada, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar biomasa sólida derivada de remolacha azucarera y/o caña de azúcar;

(b) licuar dicha biomasa sometiéndola a una mezcla de enzimas que comprende actividad celobiohidrolasa, beta-glucosidasa y poligalacturonasa a una biomasa licuada con un contenido de sólidos insolubles restantes de menos del 2% (p/p) ; y

(c) fermentar los azúcares liberados de la biomasa licuada para dar uno o más productos de fermentación.

En una realización preferida de este aspecto, las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente. En otra realización preferida de la invención, se añade un producto químico o microorganismo para hacer que el material del procedimiento sea estable en almacenamiento.

Figuras La figura 1 muestra la influencia de dosificar enzimas sobre la composición y el rendimiento de azúcar.

La figura 2 muestra el efecto de la adición de H2SO4 sobre el rendimiento de sacáridos y el pH de reacción.

La figura 3 muestra los perfiles de crecimiento microbiano y de glucosa de hidrolizado de remolacha azucarera (SBH, sugar beet hydrolysate) no esterilizado con (ensilado) y sin (no ensilado) adición de Lactobacillus amylovorus.

La figura 4 muestra una comparación de la licuación enzimática concurrente/secuencial y procedimientos de ensilado.

La figura 5 muestra el perfil de pH y el crecimiento celular de Clostridium saccharobutylicum (DSMZ 13864) en un medio de remolacha azucarera licuada.

La figura 6 muestra la producción de ABE por Clostridium saccharobutylicum (DSMZ 13864) en un medio de remolacha azucarera licuada.

La figura 7 muestra la fermentación etanólica de hidrolizado de remolacha azucarera usando S. cerevisiae.

Descripción detallada de la invención En la etapa (a) del procedimiento de la presente invención, se proporciona biomasa de remolacha azucarera y/o biomasa de caña de azúcar.

El término “biomasa de remolacha azucarera” se refiere al tejido de raíz completo y sin procesar de Beta vulgaris incluyendo la piel externa y la pulpa interna. El tejido seco de Beta vulgaris contiene un 80% (p/p) de sacarosa soluble, mientras que la pulpa de remolacha está compuesta por aproximadamente un 90% de azúcares poliméricos, incluyendo un 7% de pectina, un 7% de celulosa y un 7% de hemicelulosa en forma de arabinano. El término “biomasa de caña de azúcar” se refiere a los tallos completos y sin procesar de Saccharum sp. incluyendo la piel externa y la pulpa interna. El tejido seco de Saccharum sp. contiene un 80% (p/p) de sacarosa soluble, mientras que el bagazo de caña seco está compuesto por aproximadamente un 70%... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de un producto licuado, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar material de biomasa de remolacha azucarera y/o caña de azúcar;

(b) licuar dicha biomasa sometiéndola a una mezcla de enzimas que comprende celobiohidrolasa, betaglucosidasa y poligalacturonasa para dar un producto licuado con un contenido de sólidos insolubles restantes de menos del 2% (p/p) .

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que un producto químico o microorganismo se añade antes de o durante la etapa (b) para hacer que el producto licuado sea estable en almacenamiento.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el producto químico se seleccionada del grupo de ácido

inorgánico, anhídridos inorgánicos o en el que el microorganismo es uno o más seleccionados de Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Saccharomyces y Clostridium.

4. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo durante de 2 a 20 horas. 20

5. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de enzimas se usa en una cantidad del 0, 025 al 0, 1% (p/p) de la biomasa.

6. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de enzimas contiene

del 1 al 4% (p/p) de celobiohidrolasa, del 1 al 4% (p/p) de beta-glucosidasa y del 35 al 45% (p/p) de poligalacturonasa, con respecto al peso total de la mezcla de enzimas.

7. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que no se lleva a cabo ninguna reducción mecánica de tamaño durante la etapa de procedimiento (b) . 30

8. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla de enzimas contiene adicionalmente una o más actividades hemicelulasa.

9. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que no se añade nada de 35 invertasa a la mezcla de enzimas.

10. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, que se lleva a cabo en un único tanque.

11. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto químico o los 40 microorganismos se añaden a la biomasa sólida antes que o junto con la mezcla de enzimas.

12. Biomasa licuada derivada de remolacha azucarera y/o caña de azúcar, que es estable en almacenamiento y fermentable, y que puede obtenerse mediante un procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 11, según lo cual estable en almacenamiento significa que el aumento en unidades formadoras de 45 colonia que se detectan en placas de agar LB sólido tras almacenamiento de 6 meses a TA es de menos de 1000 ufc/ml.

13. Biomasa licuada según la reivindicación 12, que tiene un contenido en sacarosa del 0 al 50% (p/p) , un contenido en fructosa del 20 al 45% (p/p) y un contenido en glucosa del 50 al 70% (p/p) . 50

14. Uso de la biomasa licuada según una o más de las reivindicaciones 12 ó 13 para la producción de un producto que resulta de fermentación.

15. Procedimiento de fermentación, que comprende las etapas de: 55

(a) proporcionar una biomasa licuada según una o más de las reivindicaciones 12 ó 13,

(b) ajustar opcionalmente el pH de la biomasa licuada,

(d) separar el producto de fermentación.

(c) someterla a una fermentación con bacterias, levaduras u hongos, y