Diagnósticos para nefropatía membranosa.

Un método para diagnosticar la nefropatía membranosa (MN) en un sujeto,

el método que comprende detectar la presencia de anticuerpos que son reactivos a un receptor de fosfolipasa A2 (PLA2R), en donde los anticuerpos se encuentran en una muestra de un sujeto.

Diagnósticos para nefropatía membranosa Antecedentes de la invención

El síndrome nefrótlco, que se caracteriza por edema y grandes cantidades de proteína en la orina, es un trastorno relativamente común del riñón que tiene muchas causas posibles, incluyendo la nefropatía membranosa (MN), glomeruloesclerosls focal y segmentaria, enfermedad de cambios mínimos, nefropatía diabética, glomerulonefritls membranoprollferatlva, así como otras causas. Aunque existen tratamientos no-específicos que mejoran algunos de los signos y síntomas de la afección nefrótlca, el conocimiento específico de la enfermedad subyacente es generalmente necesario para guiar el tratamiento definitivo. Cuando un paciente con el síndrome nefrótlco se evalúa inicialmente en forma ambulatoria o en el hospital, se Indica generalmente por el médico un panel de pruebas de sangre para buscar causas potenciales que son detectables por serología (por ejemplo, la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA) y/o anticuerpos anti-ADN bicatenario en el contexto de los hallazgos típicos en el sedimento pueden sugerir nefritis por lupus). En la actualidad no hay una prueba serológica para identificar MN, y el diagnóstico se basa exclusivamente en la biopsia renal, un procedimiento invasivo que requiere hospitalización durante la noche en muchas instituciones y que puede ser complicado por gran sangrado Interno. MN puede estar causada por una serie de factores secundarios, tales como el lupus erltematoso sistémlco, hepatitis B, o sífilis, y las pruebas de sangre son rutinariamente enviadas a buscar estas causas (ANA, antígenos anti-hepatitis B, reagina plasmática rápida (RPR), respectivamente). Sin embargo, en los Estados Unidos, MN es más frecuentemente primario o idiopático, en su origen y como se mencionó anteriormente, ninguna prueba de sangre para esta forma existe en la actualidad. Por lo tanto, hay una necesidad de identificar la causa subyacente de MN y desarrollar una prueba simple, no invasiva para diagnosticar MN y seguir la respuesta al tratamiento.

Breve descripción de la Invención

Las modalidades de la invención se basan en el descubrimiento de que la causa subyacente de la nefropatía membranosa (MN) ¡dlopática es la presencia de auto-anticuerpos contra el receptor de fosfolipasa A2 tipo M (PLA2R) que se expresa en los glomérulos del riñón. Los auto-anticuerpos son predominantemente de la subclase lgG4. Además, los auto-anticuerpos anti-PLA2R de las subclases IgGI, lgG2, e lgG3 estuvieron presentes también. Los sueros de individuos que tienen MN idiopática tienen cantidades detectables de dichos auto-anticuerpos. Saber que la presencia de auto-anticuerpos se asocia con MN y que PLA2R es el objetivo de estos auto-anticuerpos ha permitido el desarrollo de un inmunoensayo serológico simple para el diagnóstico de MN idiopática. Esta detección de auto- anticuerpos anti-PLA2R proporciona un método rápido, preciso y rentable, seguro y no Invasivo de diagnóstico de MN idiopática, en comparación con el método actual de una biopsia de tejido renal.

Como consecuencia, en una modalidad, se proporciona en la presente descripción un método para diagnosticar MN en un sujeto, el método que comprende detectar la presencia de anticuerpos que son reactivos a una PLA2R, en donde los anticuerpos se encuentran en una muestra obtenida de un sujeto. Los anticuerpos se pueden detectar mediante un inmunoensayo en el que se forma un complejo antlcuerpo-proteína. Los anticuerpos se encuentran en la muestra del sujeto, por ejemplo suero. El sujeto es un humano y la MN es idiopática. Antes del método de diagnóstico, no se realiza una biopsia del riñón. Los individuos sanos tienen auto-anticuerpos anti-PLA2R mínimos o indetectables por ELISA convencional o inmunoelectrotransferencia. Los individuos con MN Idiopática tienen cantidad significativa de auto- anticuerpos anti-PLA2R detectables, al menos 1% más de auto-anticuerpos anti-PLA2R detectados por encima de los un individuo no-MN sano o el nivel obtenido para una población de Individuos no-MN saludables por ELISA convencional o inmunoelectrotransferencia como se describe en la presente. Por otra parte los niveles de autoanticuerpos se corresponden con las características clínicas de la condición de la enfermedad por ejemplo, proteinuria y síndrome nefrótico. Los pacientes en remisión después del tratamiento eficaz tienen auto-anticuerpos anti- PLA2R mínimos o indetectables por ELISA convencional o inmunoelectrotransferencia. Como un ejemplo, se entiende por cantidad indetectable de auto-anticuerpos anti-PLA2R, que no se observe banda visible en un análisis de inmunoelectrotransferencia realizado como se describe en el Ejemplo 1, en donde el suero humano se diluye 1:1 y se usa en los ensayos de transferencia descritos en la presente. En una modalidad, la cantidad de auto-anticuerpos anti- PLA2R en un individuo sano no-MN o la cantidad promedio en una población de individuos sanos no-MN como se determina por ELISA convencional o inmunoelectrotransferencia que se expone en el Ejemplo 1 se puede considerar como el nivel de referencia anterior o el de control. Las muestras de suero recogidas a partir de los individuos sanos no- MN se diluyen 1: 1 y se usan en ensayos de Inmunoelectrotransferencia. La intensidad de la banda visible se cuantifica por densitometría La intensidad de la densitometría se puede calibrar con un intervalo de título conocido de anti anticuerpos PLA2R que reaccionan con una cantidad fija de antígeno PLA2R. Por ejemplo, el intervalo de titulo de anticuerpo conocido puede ser pg/ml,.5 pg/ml, 1. pg/ml, 1.5 pg/ml, 2. pg/ml, 2.5 pg/ml, 3. pg/ml, 5 pg/ml, 7.5 pg/ml, 1 pg/ml, y 15 pg/ml y la cantidad fijada de PLA2R puede ser.5 pg en una membrana de transferencia. Comparando la intensidad de densitometría de una muestra humana con la curva de calibración, es posible estimar el título del anti-PLA2R en la muestra. Para los datos recogidos de una población de individuos, se calcula el valor

promedio y un orden de la desviación estándar. Idealmente, una población tiene aproximadamente 25 individuos sanos no-MN, preferentemente más. Las estadísticas, el valor promedio y un orden de la desviación estándar se pueden cargar en el sistema informático y medio de almacenamiento de datos. Los pacientes que tienen al menos 1% más que esta cantidad promedio de los auto-anticuerpos anti-PLA2R es probable que tenga MN, especialmente si el paciente también presenta las características significativas clínicas de la enfermedad, por ejemplo protelnurla y síndrome nefr ótico.

En una modalidad, los auto-anticuerpos en la muestra son reactivos contra el PLA2R que se extrajo de los tejidos de mamíferos o PLA2R de mamífero recomblnante, por ejemplo el PLA2R humana o porcina. La muestra del sujeto puede ser una muestra de sangre. En otras modalidades, la muestra es una muestra de suero o plasma.

En una modalidad, los auto-anticuerpos se detectan mediante un ¡nmunoensayo serológico, tal como un ensayo de ¡nmunoabsorción ligado a enzimas o un ¡nmunoensayo nefelométrico.

En una modalidad, el método incluye una evaluación pronóstico de un sujeto que se trata por nefropatía membranosa, el método que comprende: (a) medir un nivel de anticuerpos que son reactivos a una PLA2R en al menos dos muestras biológicas obtenidas de un sujeto paciente a diferentes tiempos, en donde los diferentes tiempos son un primer punto de tiempo y un segundo punto de tiempo, en donde el segundo punto de tiempo es después del primer punto de tiempo, y en donde el paciente se somete a tratamiento para MN; y (b) comparar los niveles de los anticuerpos en al menos dos muestras biológicas, en donde una disminución en el nivel de anticuerpos tomado en el segundo punto de tiempo en comparación con el primer punto de tiempo indica que el tratamiento es eficaz, en donde un aumento en el nivel de los anticuerpos tomados en el segundo punto de tiempo en comparación con el primer punto de tiempo indica que el tratamiento no es eficaz, y en donde cuando el nivel de anticuerpos en el segundo punto de tiempo disminuye por debajo del límite de detección del ¡nmunoensayo, indica que hay remisión. La disminución es al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, 1% y todos los porcentajes entre 1-1%. El nivel de los anticuerpos puede ser detectado mediante un ¡nmunoensayo en donde se forma un complejo anticuerpo-proteína y se detecta el complejo. Los anticuerpos se encuentran en la muestra del sujeto, por ejemplo suero. En una modalidad, el tratamiento es un tratamiento inmunosupresivo. En una modalidad, el nivel de anticuerpos en un punto de tiempo más tarde, por ejemplo el segundo punto de tiempo, es entre 95-1% o inferior comparado con... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar la nefropatía membranosa (MN) en un sujeto, el método que comprende detectar la presencia de anticuerpos que son reactivos a un receptor de fosfolipasa A2 (PLA2R), en donde los anticuerpos se encuentran en una muestra de un sujeto.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la MN es idiopática.

3. El método de la reivindicaciones 1 o 2, en donde el sujeto es un humano.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la muestra es una muestra de sangre.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde los anticuerpos son de las subclases de IgG:

lgG1-4.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la detección se lleva a cabo por un ¡nmunoensayo serológlco.

7. El método de la reivindicación 6 en donde el ¡nmunoensayo comprende:

a. medir un nivel de anticuerpos que son reactivos a un PLA2R en al menos dos muestras biológicas obtenidas de un paciente sujeto en diferentes momentos, en donde los diferentes tiempos son un primer intervalo de tiempo y un segundo Intervalo de tiempo, en donde el segundo intervalo de tiempo es después del primer Intervalo de tiempo, y en donde el paciente está en tratamiento por MN; y

b. comparar los niveles de los anticuerpos en el al menos dos muestras biológicas, en donde una disminución en el nivel de los anticuerpos tomados en el segundo Intervalo de tiempo en comparación con el primer intervalo de tiempo indica que el tratamiento es eficaz, en donde un aumento en el nivel de los anticuerpos tomados en el segundo Intervalo de tiempo en comparación con el primer intervalo de tiempo indica que el tratamiento no es eficaz, y en donde cuando el nivel de anticuerpos en el segundo Intervalo de tiempo disminuye por debajo de un límite de detección del ¡nmunoensayo, indica que existe remisión.

8. El método de la reivindicación 6 en donde el ¡nmunoensayo comprende:

a. medir un nivel de anticuerpos que son reactivos a un PLA2R en una muestra biológica obtenida de un paciente sujeto que presenta síntomas de la MN; y

b. comparar el nivel de los anticuerpos en la muestra biológica con unos datos de control, en donde un aumento detectable en los anticuerpos que son reactivos a PLA2R en la muestra por encima de esos datos de control indica la probabilidad de MN.

9. El método de la reivindicación 7, en donde el tratamiento es un tratamiento inmunosupresivo.

1. Una composición para uso en el tratamiento de MN idiopática, la composición que comprende un PLA2R o fragmentos antigénicos de este.

11. El uso de una cantidad eficaz de PLA2R o fragmentos de este o un vector que expresa un PLA2R o fragmentos antigénicos de este en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de MN en un sujeto.

12. PLA2R o un fragmento antigénico de este, o un vector que expresa un PLA2R o fragmentos antigénicos de este para uso en el tratamiento de MN en un sujeto, que incluye MN idiopática.

13. Un ¡nmunoensayo que comprende:

a. poner en contacto una muestra de un sujeto con un PLA2R o fragmento antigénico de este PLA2R;

b. formar un complejo anticuerpo-proteína entre el anticuerpo presente en una muestra con el PLA2R o fragmento antigénico de este PLA2R;

c. lavar para eliminar cualquier anticuerpo no unido;

d. adicionar un anticuerpo de detección que se marca y es reactivo con el anticuerpo de la muestra;

e. lavar para eliminar cualquier anticuerpo de detección marcado no unido; y

f. convertir la etiqueta a una señal detectable, en donde la presencia de una señal detectable indica la probabilidad de MN, que incluye MN idiopática en el sujeto.

14. El inmunoensayo de la reivindicación 13, en donde la muestra es una muestra de sangre.

15. El inmunoensayo de cualquiera de la reivindicación 13, en donde el PLA2R o fragmento antigénico de este PLA2R se deposita o inmoviliza sobre un soporte sólido, y en donde el soporte está opcionalmente en el formato de una varilla graduada, una tira de prueba, una perla de látex, una microesfera o una placa de múltiples pocilios.

16. El inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde el anticuerpo de detección se marca mediante enlace covalentemente a una enzima, etiqueta con un compuesto fluorescente o metal, o etiqueta con un compuesto quimioluminiscente.

17. El inmunoensayo de cualquier de las reivindicaciones 13-16, en donde el anticuerpo de detección es específicamente reactivo con las especies del sujeto.

18. El inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en donde la señal detectable se compara con un conjunto de señales detectables de una curva de titulación derivada de inmunoensayos de cantidades conocidas de PLA2R o fragmentos antigénicos en cantidad creciente.