Detección de ácidos nucleicos por el método de captura híbrida de tipo específico.

Un método de detección de un ácido nucleico diana que comprende:

a) hibridar un ácido nucleico diana de cadena sencilla o parcialmente sencilla con una sonda de secuencia de captura y una sonda de secuencia de señal para formar híbridos de doble cadena entre dichas sondas y el ácido nucleico diana, en donde la sonda de secuencia de captura y la sonda de secuencia de señal son capaces de hibridarse con regiones no solapadas del ácido nucleico diana y no se hibridan entre ellas.

b) añadir una sonda bloqueadora a la reacción de hibridación, en donde dicha sonda bloqueadora se hibrida a un exceso no hibridado de sondas de secuencia de captura.

c) unir el híbrido a una fase sólida para formar un híbrido unido; y

d) detectar el híbrido unido.

Detección de ácidos nucleicos por el método de captura híbrida de tipo específico

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de los métodos de detección de ácidos nucleicos en general y más particularmente se refiere a la detección de ácidos nucleicos por el método de captura híbrida de dirección específica.

Antecedentes de la invención

La detección de secuencias específicas de ácido nucleico presentes en una muestra biológica es importante para identificar y clasificar microorganismos, diagnosticar enfermedades infecciosas, detectar y caracterizar anormalidades genéticas, identificar cambios genéticos asociados con el cáncer, estudiar la susceptibilidad genética a enfermedades, y medir la respuesta a varios tipos de tratamiento. Una técnica común para detectar y cuantificar secuencias específicas de ácido nucleico es la hibridación de ácido nucleico.

Hay disponibles varios métodos de hibridación para la detección y estudio de ácidos nucleicos. En un método de hibridación tradicional, los ácidos nucleicos que se van a identificar están o en una solución o fijados en un soporte sólido. Los ácidos nucleicos se detectan utilizando sondas de ácidos nucleicos marcados que son capaces de hibridarse a los ácidos nucleicos. Recientemente, hay nuevos métodos de hibridación que ofrecen mejoras significativas sobre los métodos tradicionales, que siguen careciendo de capacidad para discriminar entre secuencias de ácido nucleico altamente homólogas.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método de hibridación que no solo sea rápido y sensible sino que también sea altamente específico y capaz de discriminar secuencias de ácido nucleico diana altamente homólogas.

El documento US5641630 desvela un método para la detección de una secuencia de ácido nucleico diana seleccionada que implica la hibridación de la secuencia de ácido nucleico diana a una primera sonda de ácido nucleico de cadena única, para lo que la primera secuencia de sonda se une covalentemente a un primer agente complejante. Una segunda sonda de ácido nucleico de cadena sencilla, que tiene una secuencia complementaria a una parte diferente seleccionada de la secuencia diana que la que es complementaria a la primera sonda, se hibrida a la diana y se une un grupo indicador detectable a las secunda secuencia de la sonda.

El documento US5681697 desvela un método para detectar analitos de ácido nucleico en una muestra. El método utiliza dos o más moléculas "extensoras de captura" distintas, cada una de las cuales se tienen que unir al analito así como al soporte unido a las sondas de captura. Esto hace posible la unión de una mayor cantidad de marcadores en el complejo analito-sonda.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método de detección de ácidos nucleicos, que se denomina en el 45 presente documento como captura híbrida específica de diana ("TSHC") . La TSHC es un método altamente específico y sensible que es capaz de discriminar y detectar secuencias altamente homólogas de ácido nucleico diana.

En una realización, el método se refiere a la detección de un ácido nucleico diana en que el ácido nucleico dirigido, que es de cadena sencilla o parcialmente de cadena sencilla, se hibrida simultáneamente, o secuencialmente, a una sonda de secuencia de captura y una sonda de secuencia de señal sin marcar. Estas sondas se hibridan a las regiones no solapadas del ácido nucleico diana y no entre ellas de manera que se forman híbridos de doble cadena. Los híbridos se capturan en una fase sólida y se detectan. En una realización preferida, se forma un híbrido ADN/ARN entre el ácido nucleico diana y la sonda de secuencia de señal. Utilizando este método, se puede 55 conseguir la detección, por ejemplo, uniendo un anticuerpo marcado capaz de reconocer el híbrido ADN/ARN al híbrido de doble cadena, detectando de esta manera el híbrido.

En otra realización, la sonda de secuencia de señal que se utiliza en el método de detección es una molécula de ácido nucleico que comprende un dúplex ADN/ARN y una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla que es capaz de hibridarse al ácido nucleico diana de cadena sencilla o parcialmente de cadena sencilla. La detección se puede conseguir, por ejemplo, uniendo un anticuerpo marcado capaz de reconocer la parte dúplex ADN/ARN de la sonda de secuencia de señal, detectando de esta forma el híbrido formado entre el ácido nucleico diana, la sonda de secuencia de captura y la sonda de secuencia de señal.

En otra realización más, la sonda de secuencia de señal que se utiliza en el método de detección es una molécula que no contiene secuencias que sean capaces de hibridarse al ácido nucleico diana de cadena sencilla o

parcialmente de cadena sencilla. Se utilizan sondas puente que comprenden secuencias que son capaces de hibridarse al ácido nucleico diana así como secuencias que son capaces de hibridarse a la sonda de secuencia de señal. En esta realización, la sonda de secuencia de señal comprende una parte dúplex ADN/ARN y una parte de secuencia de ADN de cadena sencilla que contiene secuencias complementarias a las secuencias en la sonda puente. La secuencia puente, que se hibrida con ambos, el ácido nucleico diana y la sonda de secuencia de señal, sirviendo por lo tanto como intermediaria para conectar la sonda de secuencia de señal al ácido nucleico y la sonda de secuencia de captura que está hibridada con el ácido nucleico diana.

En otra realización del método TSHC de la invención, se utilizan sondas bloqueadoras que comprenden oligonucleótidos complementarios a las sondas de captura de secuencia en el método para eliminar el exceso de sondas de captura de secuencia, reduciendo de esta manera la señal de fondo de la detección y aumentando la especificidad del ensayo.

La presente invención también se refiere a nuevas sondas. Estas sondas son secuencias de ácido nucleico que 15 pueden funcionar en varios ensayos de hibridación, incluyendo, por ejemplo, el ensayo TSHC.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra una realización del método de captura híbrida específica de la diana. La Figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra una realización del método de captura híbrida específica de la diana. La Figura 3 es un diagrama esquemático que ilustra los posibles mecanismos de acción de una realización que emplea sondas de captura de secuencia fusionadas.

La Figura 4 muestra la sensibilidad y sensibilidad analítica de la detección de HSV-1 por captura híbrida específica de la diana. La Figura 5 muestra la sensibilidad y sensibilidad analítica de la detección de HSV-2 por captura híbrida específica de la diana. Las Figuras 6A-6D muestra las distintas realizaciones del método captura-plus híbrida específica de la diana. La Figura 7 muestra la realización de eliminación de sonda del método de captura híbrida específica de la diana.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar la presencia de ácidos nucleicos en muestras de ensayo. Más específicamente, la invención proporciona un método altamente específico y sensible que es capaz de discriminar y detectar secuencias de ácido nucleico altamente homólogas. Los usos preferidos para la presente invención son bien conocidos por los expertos y se pueden aplicar para la detección y discriminación de varias mutaciones que incluyen, pero no se limitan a inserciones, eliminaciones, inversiones, secuencias repetidas, y múltiples así como polimorfismos de nucleótido único (SNP) . Adicionalmente, la presente invención puede ser también específica de grupo para la detección de dianas de ácido nucleico que comparten elementos de secuencia similares.

Se puede utilizar cualquier fuente de ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, como muestra de ensayo. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede ser un producto alimentario o agrícola o un especimen clínico humano o 45 veterinario. Normalmente, la muestra de ensayo es un fluido biológico tal como la orina, sangre, plasma, suero, esputo o similar. De manera alternativa la muestra de ensayo puede ser un especimen de tejido sospechoso de tener un ácido nucleico de interés. El ácido nucleico diana en la muestra de ensayo puede estar presente inicialmente como un molécula separada de forma que la secuencia que se va a detectar constituye el ácido nucleico completo, o puede ser un componente de una molécula más grande. No es necesario que la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar esté presente inicialmente... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección de un ácido nucleico diana que comprende:

a) hibridar un ácido nucleico diana de cadena sencilla o parcialmente sencilla con una sonda de secuencia de captura y una sonda de secuencia de señal para formar híbridos de doble cadena entre dichas sondas y el ácido nucleico diana, en donde la sonda de secuencia de captura y la sonda de secuencia de señal son capaces de hibridarse con regiones no solapadas del ácido nucleico diana y no se hibridan entre ellas. b) añadir una sonda bloqueadora a la reacción de hibridación, en donde dicha sonda bloqueadora se hibrida a un exceso no hibridado de sondas de secuencia de captura. c) unir el híbrido a una fase sólida para formar un híbrido unido; y d) detectar el híbrido unido.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la sonda de secuencia de captura está inmovilizada.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la sonda de secuencia de señal es de cadena sencilla.

4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la sonda de secuencia de captura y la sonda de secuencia de señal se hibridan con regiones del ácido nucleico diana, en donde las regiones están separadas menos de 3 kilobases.

5. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la sonda de secuencia de captura y la sonda de secuencia de señal se hibridan con regiones del ácido nucleico diana, en donde las regiones están separadas menos de 500 bases.

6. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la sonda de secuencia de captura es una fusión de dos o más secuencias complementarias de diferentes regiones el ácido nucleico diana o de diferentes moléculas diana.

7. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el híbrido de doble cadena que se forma es un híbrido ADN/ARN.

8. El método de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además la etapa de formación de un ácido nucleico diana de cadena sencilla o parcialmente sencilla antes de la etapa de hibridación.

9. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la hibridación de la sonda de secuencia de captura y la sonda de secuencia de señal al ácido nucleico diana se llevan a cabo secuencialmente.

10. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la etapa a) y la etapa b) y/o la etapa c) se llevan a cabo simultáneamente.

11. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la sonda bloqueadora tiene una temperatura de fusión más baja que la de la sonda de secuencia de captura.

12. El método de la reivindicación 11, en el que la fase sólida está revestida con estreptavidina.

13. El método de la reivindicación 11, en el que la fase sólida es una microplaca.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa c) se lleva a cabo a temperatura ambiente.

15. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el híbrido unido se detecta utilizando un anticuerpo que reconoce el híbrido.

16. El método de la reivindicación 15, en el que el híbrido es un híbrido ADN/ARN.

17. El método de la reivindicación 15, en el que el anticuerpo que reconoce el híbrido ADN/ARN está marcado con fosfatasa alcalina.

18. El método de la reivindicación 1 en el que la sonda de secuencia de señal comprende una región híbrida ADN/ARN, en donde dicha hibridación forma un complejo.

19. El método de la reivindicación 18 en el que la sonda de secuencia de señal comprende una longitud de al menos 40 pares de bases.

20. El método de la reivindicación 18 en el que la sonda de secuencia de captura comprende una longitud de al menos 6 pares de bases.

21. El método de la reivindicación 20 en el que la sonda de secuencia de captura está inmovilizada en una fase sólida.

22. El método de la reivindicación 18 en el que dicho complejo se detecta por la unión de un anticuerpo que reconoce la región híbrida ADN/ARN a dicha región, en donde el anticuerpo está marcado de manera detectable.

23. El método de la reivindicación 18, en el que las sondas bloqueadoras comprenden una longitud de 4-10 pares de bases menor que la longitud de la sonda de secuencia de captura.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sonda de secuencia de señal comprende una primera región que tiene una estructura de dúplex ADN/ARN y una segunda región que tiene una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el dúplex ADN/ARN es un dúplex M13 ADN -M13 ARN.

26. Un método de detección de un ácido nucleico diana, que comprende:

a) hibridar un ácido nucleico diana de cadena sencilla o parcialmente sencilla a una sonda puente, una sonda de secuencia de captura y una sonda de secuencia de señal, en donde el ácido nucleico diana y la sonda puente cuando se hibridan forman híbridos de doble cadena, y en donde la sonda de secuencia de captura y la sonda puente se hibridan a regiones no solapadas del ácido nucleico diana y no entre ellas, y la sonda de secuencia de señal se hibrida a la sonda puente y no al ácido nucleico diana ni la sonda de secuencia de captura; b) añadir una sonda bloqueadora a la reacción de hibridación, en donde dicha sonda bloqueadora se hibrida al exceso no unido de sondas de secuencia de captura; c) unir el híbrido a una fase sólida para formar un híbrido unido; y d) detectar el híbrido unido.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en el que la sonda de secuencia de señal comprende una primera región que tiene una estructura de dúplex ADN/ARN y una segunda región que tiene un ácido nucleico de cadena sencilla.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el dúplex ADN/ARN es un dúplex M 13 ADN -M13 ARN.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el dúplex ADN/ARN es un híbrido formado entre secuencias repetidas en la sonda de señal y una molécula de ácido nucleico que tiene secuencias complementarias de las secuencias repetidas.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en el que la sonda puente comprende una cola poli (A) .

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que la sonda de secuencia de señal comprende una secuencia de ADN poli (dT) de cadena sencilla que se hibrida a la cola poli (A) de la sonda puente, y un dúplex ADN/ARN que se forma entre las secuencias poli (dT) de la sonda de secuencia de señal y la molécula de ácido nucleico que tiene secuencias poli (A) .

32. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana es un polimorfismo de nucleótido simple.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la especificidad de unión del híbrido a una fase sólida está modulada por temperaturas superiores a la temperatura ambiente.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la especificidad de unión del híbrido a una fase sólida está modulada por la adición de sondas bloqueadoras.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la especificidad de unión del híbrido a una fase sólida está modulada por temperaturas superiores a la temperatura ambiente y la adición de sondas bloqueadoras.

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