Cuantificación de analito usando un análisis de dispersión inducida por flujo.

Un procedimiento para medir la concentración de un analito en una muestra,

que comprende las siguientes etapas:

a) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir,

b) determinar en una instrumentación basada en el flujo la varianza para dicho ligando,

c) determinar la varianza en la misma instrumentación para la misma concentración de dicho ligando en presencia de diferentes concentraciones (conocidas) del analito,

d) relacionar las concentraciones de analito con las varianzas determinadas en la etapa c,

e) añadir una cantidad conocida de ligando a una muestra que comprende una concentración desconocida de analito,

f) determinar la varianza para el ligando en la muestra introducida/añadida en la etapa e, y

g) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la relación establecida en la etapa d y la varianza determinada en la etapa f.

Cuantificación de analito usando un análisis de dispersión inducida por flujo.

Las interacciones no covalentes juegan un papel clave en muchos procesos bioquímicos relacionados con, por 5 ejemplo, los objetivos de fármacos o las interacciones proteína-proteína (1) . En la química combinatoria y en el desarrollo de fármacos deben abordarse en un marco de tiempo limitado un gran número de interacciones no covalentes.

A menudo, una cantidad de muestra muy pequeña está disponible para el estudio lo que impide una caracterización 10 completa usando los procedimientos existentes. Además, es complicado a partir de un punto de vista tecnológico integrar procedimientos convencionales para abordar las interacciones no covalentes con el aislamiento y/o la síntesis de objetivos vinculantes de entidades químicas (1, 2) .

El documento US 2007/0261479 divulga unos procedimientos y sistemas para monitorizar unas interacciones 15 moleculares usando el fenómeno de la dispersión de Taylor-Aris presente en el flujo de fluidos en los sistemas de microfluidos para examinar los compuestos de ensayo en los sistemas bioquímicos.

El documento US 2004/0106190 divulga un procedimiento para medir la concentración de un analito en una muestra usando un dispositivo de ensayo de flujo pasante que comprende un medio fluido que tiene un canal en 20 comunicación con un biosensor de afinidad electroquímico.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de un análisis de dispersión inducido por flujo (FIDA) para la cuantificación de 25 analitos tales como, por ejemplo, antígenos, toxinas, nucleótidos (ADN, ARN) , etc. Para flujos impulsados por presión de sustancias individuales, un FIDA es similar a las dispersiones Taylor observadas anteriormente para flujos impulsados por presión en tubos o capilares delgados. En comparación con los procedimientos existentes el nuevo enfoque es rápido (segundos/minutos en comparación con horas) barato (requisitos de volumen de muestra bajos (nL) ) y fácil de implementar (solo necesita un tubo capilar delgado y un detector) . 30

Las posibles áreas de aplicación incluyen: cuantificación de biomarcadores, diagnóstico de punto de atención y como un enfoque general para la cuantificación de analitos en un flujo basado en equipos analíticos para el análisis de laboratorio. El mismo procedimiento puede usarse para varios analitos en un sistema integrado.

Las grandes moléculas se difunden lentamente y las pequeñas moléculas se difunden comparativamente más rápido. Cuando una molécula interactúa con un ligando su aparente difusividad se convierte en la del complejo. La aparente difusividad de un ligando depende, por lo tanto, de las fracciones de analito libre y complejado que a su vez viene dada por la constante de vinculación de equilibrio analito-ligando no covalente. La idea subyacente de la presente invención es que la dispersión aparente de un ligando en un sistema de flujo se caracteriza por la 40 difusividad aparente del ligando. Es bien conocido que puede usarse la dispersión de pico para ensayar la difusividad de moléculas pequeñas, macromoléculas y partículas (3-8) . Sin embargo, solo unos pocos estudios han informado de la dispersión en sistemas con varios componentes (9-12) . Por lo tanto, midiendo la difusividad de una molécula indicadora (la sonda de afinidad o ligando) en la presencia y en la ausencia de un analito interactuante, es posible obtener la información de la concentración del analito interactuante. 45

En la presente invención se demuestra que pueden usarse una serie simple de experimentos que implican la introducción de muestras, el flujo impulsado por presión y la detección en un capilar delgado recubierto de sílice para cuantificar la constante de vinculación de equilibrio no covalente, así como la concentración de uno o más analitos en una muestra. 50

El diagnóstico molecular, por lo general, implica una interacción no covalente entre un biomarcador específico (a menudo macromoléculas endógenas, virus o bacterias) y un anticuerpo o una sonda de ADN/ARN. A partir de una interacción no covalente específica de este tipo, la concentración de biomarcadores pueden obtenerse usando un FIDA; la tecnología es, por lo tanto, muy adecuada para el diagnóstico cuantitativo rápido, incluyendo los 55 diagnósticos de punto de atención.

Un FIDA para la cuantificación de las concentraciones de analitos ofrece un nuevo enfoque para realizar análisis cuantitativos. Las principales ventajas de la técnica presente son la velocidad de análisis, la simplicidad en relación con el desarrollo del ensayo y el bajo coste. 60

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, el procedimiento para medir la concentración de un analito en una muestra comprende las siguientes etapas:

1) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir, 65

2) determinar en una instrumentación basada en el flujo la varianza para dicho ligando, 3) determinar la varianza en la misma instrumentación para la misma concentración de dicho ligando en la presencia de diferentes concentraciones (conocidas) del analito, 4) relacionar las concentraciones de analito con las varianzas determinadas en la etapa 3, 5) añadir una cantidad conocida de ligando a una muestra que comprende una concentración desconocida de analito, 5

6) determinar la varianza para el ligando en la muestra introducida/añadida en la etapa 5, y 7) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la relación establecida en la etapa 4 y la varianza determinada en la etapa 6.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento que comprende las siguientes etapas: 10

1) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir, 2) determinar en una instrumentación basada en el flujo, tal como por ejemplo un sistema de CE Agilent, la varianza (2) para dicho ligando, obtenida a partir de un ajuste de Gauss para el pico correspondiente al ligando, 3) repetir la etapa 2 con dicho ligando y diferentes concentraciones conocidas del analito, 15

4) representar 2 o 2/tr en función de la concentración de analito, 5) determinar la varianza (2) para el ligando en una muestra que comprende el analito, y 6) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la representación de la etapa 4.

En otros aspectos de la presente invención, el procedimiento se refiere a la instrumentación basada en el flujo que 20 incluye unos instrumentos dedicados a un sistema CE Agilent, HPLC o FIA y a unos procedimientos en los que el ligando comprende una etiqueta detectable y unos procedimientos en los que la muestra se selecciona a partir de cualquier fluido corporal o muestra de alimento.

En aspectos adicionales, la divulgación se refiere a unos kits para realizar el procedimiento descrito anteriormente y 25 a unos kits para realizar las partes de etapas de los procedimientos, por ejemplo, en las que las curvas convencionales de calibración ya están establecidas para su uso en el kit y los kits para su uso en la medición de unas cantidades de fluidos corporales de analito o de muestras de alimentos.

En otro aspecto más de la presente invención, puede medirse más de un analito con el mismo procedimiento y 30 usando el mismo kit.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Los UV trazan a 230 nm y 25 ºC de -naftol (50, M) en presencia y ausencia de CD en un capilar de 35 sílice fundida (i.d.: 50 m, longitud total 48, 5 cm, longitud al detector 40, 5 cm) . El eluyente fue 67 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7, 4) con o sin CD.

Figura 2. Los datos correspondientes al -naftol (+) y al naproxeno (o) se obtuvieron usando un capilar de sílice fundida (id: 50 m, longitud total de 48, 5 cm, longitud al detector 40, 5 cm) a 25 ºC. El eluyente fue 67 mM de 40 tampón de fosfato de sodio pH 7, 4 con diferentes cantidades de CD.

Figura 3. La isoterma vinculante correspondiente al sistema (analito) CD (ligando) -naftol basada en las variaciones pico, 2, divididas por los tiempos de flujo, tR. Insertado: curva convencional linealizada para determinar las concentraciones. 45

Figura 4. La curva convencional linealizada basada en los datos presentados en la figura 3. La figura muestra las variaciones pico, 2, divididas por los tiempos de flujo, tR frente al logaritmo de base 10 de la concentración de CD (analitos) . De esta manera se obtiene una relación lineal aparente.

Figura 5. La isoterma vinculante basada en las variaciones de pico, 2. La señal UV se detectó a 495 nm y el preacondicionamiento fue como se describe en la figura 2. El analito era anti-BSA (albúmina... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para medir la concentración de un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

a) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir, b) determinar en una instrumentación basada en el flujo la varianza para dicho ligando, c) determinar la varianza en la misma instrumentación para la misma concentración de dicho ligando en presencia de diferentes concentraciones (conocidas) del analito, d) relacionar las concentraciones de analito con las varianzas determinadas en la etapa c, 10

e) añadir una cantidad conocida de ligando a una muestra que comprende una concentración desconocida de analito, f) determinar la varianza para el ligando en la muestra introducida/añadida en la etapa e, y g) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la relación establecida en la etapa d y la varianza determinada en la etapa f. 15

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

a) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir, b) determinar en una instrumentación basada en el flujo, tal como por ejemplo un sistema de CE Agilent, la 20 varianza (2) para dicho ligando, obtenida a partir de un ajuste de Gauss para el pico correspondiente al ligando, c) repetir la etapa b con dicho ligando y diferentes concentraciones conocidas del analito, d) representar 2 o 2/tr en función de la concentración de analito, e) determinar la varianza (2) para el ligando en una muestra que comprende el analito, y f) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la representación de la etapa d. 25

3. Un procedimiento para medir la concentración de un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

a) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir, 30

b) determinar en una instrumentación basada en el flujo la varianza para un analito marcado en comunicación física con dicho ligando, c) determinar la varianza de dicho analito marcado en la misma instrumentación para la misma concentración de dicho analito marcado y dicho ligando, en presencia de diferentes concentraciones (conocidas) del analito, d) relacionar las concentraciones de analito con las varianzas determinadas en la etapa c, 35

e) añadir una cantidad conocida de ligando y una cantidad conocida de analito marcado a una muestra que comprende una concentración desconocida de analito, f) determinar la varianza para el analito marcado en la muestra introducida/añadida en la etapa e, y g) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la relación establecida en la etapa d y la varianza determinada en la etapa f; 40

en el que tanto el analito marcado como el analito tienen una afinidad por el ligando, y en el que el analito puede distinguirse del analito marcado.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas: 45

a) seleccionar un ligando como una sonda de afinidad para el analito a medir, b) determinar en una instrumentación basada en el flujo, tal como por ejemplo un sistema de CE Agilent, la varianza (2) para un analito marcado en comunicación física con dicho ligando, obtenida a partir de un ajuste de Gauss para el pico correspondiente al analito marcado en comunicación física con el ligando, 50

c) repetir la etapa b con dicho analito marcado en comunicación física con el ligando y diferentes concentraciones conocidas del analito, d) representar 2 o 2/tr en función de la concentración de analito, e) determinar la varianza (2) para el analito marcado en comunicación física con el ligando en una muestra que comprende el analito, y 55

f) determinar la concentración del analito en dicha muestra usando la representación de la etapa d.

5. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que tanto el ligando como el analito son grandes.

6. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en el que el ligando es grande y el analito es pequeño.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la instrumentación basada en el flujo incluye unos instrumentos reservados para una CE Agilent, otros sistemas de CE, unos sistemas de HPLC, 65 unos sistemas FCM o FIA.

8. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, en el que el ligando comprende un etiqueta detectable.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la muestra se selecciona a partir de cualquier fluido corporal. 5

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la muestra es una muestra de alimento.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la muestra de alimento es un producto lácteo. 10

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la muestra de alimento es una muestra de alimento que no comprende un producto lácteo.