Inmuno-PCR sándwich por desplazamiento.

Un metodo para detectar un analito de acido no nucleico presente en unamuestra,

en que el metodo comprende las fases de:

(i) contacta una muestra que comprende un analito de acido no nucleico conun conjugado informador, en que el conjugado informado comprende:

(a) un primer receptor capaz de unir especificamente el analito; y

(b) un marcador de acido nucleico;

(ii) permitir la union del analito al conjugado informador, formando de estamanera un complejo informador dependiente del analito;

(iii) contactar el complejo informador dependiente del analito con un segundoreceptor para el analito, en que el segundo receptor está fijado a un soporte solidomediante un puente de acido nucleico de una secuencia predeterminada que consiste endos hebras de acido nucleico por lo menos parcialmente complementarias, una de lascuales está fijada al soporte solido;

(iv) permitir la union del segundo receptor al complejo informadordependiente del analito, formando de esta manera un complejo informador dependientedel analito/segundo receptor fijado al soporte solido;

(v) eluir el complejo informador dependiente del analito/segundo receptor delsoporte solido con un acido nucleico desplazador que tenga una secuencia por lo menosparcialmente complementaria a una de las hebras de puente del acido nucleico; y

(vi) detectar especificamente la presencia del marcador de acido nucleico en elcomplejo informador dependiente del analito eluido/segundo receptor, en que ladeteccion de marcador de acido nucleico indica la presencia del analito en la muestra.

INMUNO-PCR SÁNDWICH POR DESPLAZAMIENTO

ÁMBITO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos para generar una señal en respuesta a un analito presente en una muestra. Específicamente, la invención se refiere a métodos que emplean detección por amplificación de señal de un marcador de ácido nuc1eico. Esta invención también se refiere a métodos para etiquetar anticuerpos u otras proteínas con un ácido nuc1eico, especialmente ADN; métodos para purificar anticuerpos y analitos; y métodos para seleccionar anticuerpos para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existe un inmuno ensayo típico conocido como Ensayo Inmunoenzimático Enlazado a Enzimas (ELISA) . El antígeno que va a ser detectado se extrae de la solución mediante una adsorción no específica a una superficie sólida, como por ejemplo el interior de un pocillo de placa de microtitulación. Después de lavar para eliminar el exceso de antígeno y bloquear los puntos restantes de la placa, el antígeno inmovilizado es contactado con un anticuerpo primario para formar un complejo inmune en el soporte sólido. El exceso de anticuerpo puede extraerse lavando la placa. El anticuerpo primario se detecta a través de una enzima, que puede conjugarse directamente al anticuerpo primario (ELISA directo) o a un segundo anti-anticuerpo, que posteriormente se pone en contacto con la placa (ELISA indirecto) . La actividad enzimática asociada con la superficie sólida es proporcional a la cantidad de antígeno unido presente que puede medirse, por ejemplo utilizando un sustrato cromogénico para la enzima.

Ellrnmuno-PCR es similar al ELISA indirecto, pero utiliza una secuencia de ADN en lugar de una enzima como molécula de detección (ver, por ejemplo, Sano et al., Science, 1992, 258 : 120-22) . Sano et al., demostraron la eficacia de este método con un antígeno de albumina de suero bovino (BSA) y un anticuerpo primario anti-BSA. El 5 ADN plásmido biotinilado se acopló con el anticuerpo primario vía la proteína A avidina. La amplificación del ADN asociado al antígeno por medio de 30 ciclos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) permitió la detestación mediante tintura con bromuro de etidio seguido de electroforesis de gel. Los autores informaron de una mejora en la sensibilidad de detección de aproximadamente cinco órdenes de magnitud lOen comparación con la detección de ELISA. En teoría, una etiqueta de ADN puede detectarse con una sensibilidad extraordinaria (potencialmente hasta una copia sencilla) cuando es amplificada mediante PCR o mediante cualquier otra técnica de amplificación de ácido nucleico exponencial. Sin embargo, la adición secuencial de cada componente del ensayo requiere un lavado extensivo con el fin de reducir el

material unido no específicamente.

Ellrnmuno-PCR también puede realizarse en un formato de inmuno ensayo en sándwich. Un inmuno ensayo en sándwich típico utiliza dos anticuerpos que reconocen el antígeno que va a ser detectado. Se utiliza un anticuerpo de "captura" para revestir la superficie de un soporte sólido, como por ejemplo un pocillo, una gota o una partícula de microtítulo. Se etiqueta un anticuerpo "informador" con una molécula de detección, como por ejemplo un isótopo radioactivo, un fluoróforo o una enzima. En algunos casos, puede utilizarse el mismo anticuerpo tanto para la captura como para el informe. Habitualmente, el antígeno entra en contacto en primer lugar con el anticuerpo informador en solución o con el anticuerpo de captura en el soporte sólido, seguido de la adición del anticuerpo restante. El complejo inmune específico resultante se une a la superficie del soporte sólido y consiste en el antígeno combinado con dos anticuerpos. El antígeno y los anticuerpos sobrantes son eliminados lavando de forma repetida el soporte. Es de gran importancia mantener la integridad del complejo inmune inmobilizado durante la fase de lavado con el fin de maximizar la intensidad de la señal, a la vez que se mejora la eliminación del anticuerpo informador no unido, minimizando de esta manera el fondo. Después de los lavados, el anticuerpo informador unido es medido a través de la molécula de detección, como indicación de la cantidad de antígeno presente.

El anticuerpo informador puede ser etiquetado directamente mediante una modificación covalente del anticuerpo, o indirectamente a través del enlace de un segundo anticuerpo o proteína que posea una etiqueta detectable. La adhesión indirecta puede conseguirse, por ejemplo, etiquetando el anticuerpo informado con biotina y adhiriendo la molécula de detección a la avidina. Cuando el sistema de detección es lo suficientemente sensible, el límite inferior del ensayo quedará determinado normalmente por el grado de fondo producido por el enlace no específico del anticuerpo informador no unido.

También se han indicado ejemplos de immuno-PCR sándwich en la literatura (ver, por ejemplo, Joerger et al., Clin Chem, 1995, 41: 1371-77; Hendrickson et al., Nucleic Acids Res, 1995, 23: 522-529) . Los límites de detección para el formato de ensayo de Immuno-PCR exceden los de los inmunoensayos de enzimas convencionales. Sin embargo, es necesario realizar una limpieza astringente, utilizando por ejemplo una solución detergente, para eliminar los anticuerpos informadores con etiqueta ADN no específicamente unidos.

EP 1 249 500 se refiere a un método para la detección de un analito, en que un soporte sólido se acopla con una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia complementaria se acopla a un anticuerpo por medio de una interacción de biotina -avidina utilizando una secuencia de ácido nucleico biotinilado y un anticuerpo adherido a la avidina. También explica la unión de un ácido nucleico marcador detectable por PCR a un segundo anticuerpo de analito específico por medio de interacciones de biotina -avidina.

El formato de sándwich del Immuno-PCR también ha sido utilizado para demostrar la detección de múltiples antígenos ("multiplexación") (ver, por ejemplo, Pat. No. US 5, 985, 548) . Las etiquetas de ADN de diferente longitud fueron adheridas cada una de ellas con anticuerpos informadores que reconocen diferentes antígenos que utilizan un éster de 5'N-hidroxisuccinimida (NHS) . Los conjugados de ADN de anticuerpo informador -ADN se vincularon a un soporte sólido revestido con los diferentes antígenos. Las múltiples etiquetas de ADN fueron detectadas de forma simultánea en el ensayo en base a los tamaños de los productos de amplificación de PCR respectivos, que habían sido diseñados para permitir la resolución de cada uno de los otros por electroforesis de gel.

El Immuno-PCR ofrece una mejora real en sensibilidad sobre los inmunoensayos actuales, pero presenta un gran número de oportunidades por lo que se refiere a generar fondo. El fondo puede generarse a partir del enlace no específico de cualquier componente, incluyendo el conjugado de anticuerpo -ADN informador, la proteína quimérica u otro componente de etiquetado secundario. Dado que las moléculas individuales de ácido nucleico pueden ser detectadas por el PCR, si se deja de eliminar todas las moléculas de ADN modelo no específicamente unidas, ello provoca un fondo significativo, e interfiere con la capacidad de detectar cantidades minúsculas de analito. Los lavados astringentes, numerosos o prolongados para reducir los productos no específicos han sido utilizados para reducir el fondo, pero pueden tener

como resultado una señal reducida debido a la elución o la disociación de complejos de antígenos/anticuerpos. De la misma manera, el Immuno-PCR está limitado por la ya conocida no-linealidad del PCR, que puede frustrar los intentos de evaluar las cantidades proporcionadas de analito presentes. Estas diferencias prácticas han impedido que las técnicas de Immuno-PCR consigan una aceptación y una utilidad globales en este campo.

Se ha sugerido una variedad de métodos para reducir el fondo en métodos tanto de inmuno ensayo standard como de Immuno-PCR. Ishikawa et al. (Pat. No. US 5, 888, 834) han propuesto la técnica de inmuno ensayo de transferencia de complejos inmunes, en la cual un complejo inmune sándwich es liberado del soporte de captura y recapturado sobre una superficie nueva. Los componentes informadores no específicamente unidos quedan en el soporte sólido inicial. WO 02/83951 revela la unión de un analito mediante un conjugado de un ligando que se une con un analito, una secuencia de PNA y una etiqueta, como por ejemplo biotina. El conjugado no unido eliminado uniéndolo a una fase sólida o pasando a través de una membrana. A continuación, el nivel de PNA es liberado preferiblemente del complejo analitoconjugado... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un analito de ácido no nuc1eico presente en una muestra, en que el método comprende las fases de:

(i) contactar una muestra que comprende un analito de ácido no nuc1eico con un conjugado informador, en que el conjugado informado comprende:

(a) un primer receptor capaz de unir específicamente el analito; y

(b) un marcador de ácido nuc1eico;

(ii) permitir la unión del analito al conjugado informador, formando de esta manera un complejo informador dependiente del analito;

(iii) contactar el complejo informador dependiente del analito con un segundo receptor para el analito, en que el segundo receptor está fijado a un soporte sólido mediante un puente de ácido nuc1eico de una secuencia predeterminada que consiste en dos hebras de ácido nucleico por lo menos parcialmente complementarias, una de las cuales está fijada al soporte sólido;

(iv) permitir la unión del segundo receptor al complejo informador dependiente del analito, formando de esta manera un complejo informador dependiente del analito/segundo receptor fijado al soporte sólido;

(v) eluir el complejo informador dependiente del analito/segundo receptor del soporte sólido con un ácido nuc1eico desplazador que tenga una secuencia por 10 menos parcialmente complementaria a una de las hebras de puente del ácido nuc1eico; y

(vi) detectar específicamente la presencia del marcador de ácido nuc1eico en el complejo informador dependiente del analito eluído/segundo receptor, en que la detección de marcador de ácido nuc1eico indica la presencia del analito en la muestra.

2. El método según la reivindicación 1, en que detectar la presencia del marcador de ácido nuc1eico comprende:

(i) contactar el complejo informador dependiente del analito eluído/segundo receptor con una composición de replicación de ácido nucleico capaz de replicar la secuencia de marcador de ácido nucleico,

(ii) replicar el marcador de ácido nucleico; y

(iii) visualizar el marcador de ácido nucleico replicado mediante tintura con bromuro de etidio.

3. El método según la reivindicación 2, en que el marcador de ácido nucleico es replicado con una polimerasa.

4. El método según la reivindicación 3, en que la polimerasa es seleccionada a partir del grupo que consiste en una polimerasa de ADN, una polimerasa de ARN, una transcriptasa y una polimerasa Q-beta.

5. El método según la reivindicación 2, en que la composición de replicación comprende reactivos y cebadores para realizar una reacción en cadena de polimerasa, y en que replicar el marcador de ácido nucleico comprende amplificar el marcador de ácido nucleico mediante la reacción en cadena de polimerasa.

6. El método según la reivindicación 1, en que el primer y el segundo receptores son anticuerpos, y el analito de ácido no nucleico es un antígeno o un hapteno.

7. El método según la reivindicación 5, en que la reacción en cadena de la 20 polimerasa es una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real.

8. El método según la reivindicación 1, en que el analito es PSA.

9. El método según la reivindicación 1, en que la muestra es una muestra de suero y el analito se encuentra presente a una concentración de menos de 10 picogramos por milímetro.

10. El método según la reivindicación 1, que también comprende la fase de lavar el complejo informador dependiente de analito/segundo receptor fijado al soporte sólido formado en la fase (iv) antes de eluir el complejo informador dependiente de analito/segundo receptor del soporte sólido con un ácido nuc1eico desplazador en la fase (v) .

11. El método según la reivindicación 1, en que las fases comprenden:

(i) contactar una muestra que comprende una multiplicidad de analitos de ácido no nuc1eico diferentes con una multiplicidad de conjugados informadores, en que cada conjugado informador comprende: (a) un primer receptor capaz de unir específicamente uno de la multiplicidad de analitos de ácido no nucleico en la muestra; y (b) un marcador de ácido nuc1eico, en que cada conjugado informador se une específicamente a un analito diferente, y comprende un ácido nuc1eico que es distinguible de los otros ácidos nuc1eicos en la multiplicidad de conjugados informadores;

(ii) permitir la unión de la multiplicidad de analitos de ácido no nuc1eico en la muestra a la multiplicidad de conjugados receptores, formando de esta manera una multiplicidad de complejos informadores dependientes del analito;

(iii) contactar la multiplicidad de complejos informadores dependientes del analito con una multiplicidad de segundos receptores, en que la multiplicidad de segundos receptores es capaz colectivamente de unirse a la multiplicidad de analitos en la muestra, y en que los segundos receptores están fijados a un soporte sólido mediante un puente de ácido nucleico de una secuencia predeterminada;

(iv) permitir la unión de los segundos receptores a los complejos informadores dependientes del analito, formando de esta manera una multiplicidad de complejos informador dependiente del analito/segundo receptor fijados al soporte sólido;

(v) eluir la multiplicidad de complejos informador dependiente del

analito/segundo receptor del soporte sólido con por lo menos un ácido nucleico desplazador; y

(vi) detectar específicamente la presencia de los marcadores de ácido nuc1eico en la multiplicidad eluída de complejos informador dependiente de analito/segundo receptor mediante:

(a) contactar la multiplicidad eluída de complejos informador dependiente de analito/segundo receptor con una replicación de ácido nucleico capaz de replicar los marcadores de ácido nucleico;

(b) replicar simultáneamente todos los marcadores de ácido nucleico distinguibles; y

(c) visualizar el marcador de ácido nuc1eico replicado mediante tintura con bromuro de etidio, en que la detección de cada

marcador de ácido nuc1eico distinguible indica la presencia del analito correspondiente en la muestra.

12. El método según la reivindicación 11, en que los marcadores de ácido nucleico son replicados con una polimerasa.

13. El método según la reivindicación 12, en que la polimerasa se selecciona a partir del grupo que consiste en una polimerasa de ADN, una polimerasa de ARN, una transcriptasa y una polimerasa Q-beta.

14. El método según la reivindicación 11, en que la composición de replicación de ácido nucleico comprende reactivos y cebadores para realizar una reacción en cadena de polimerasa, y en que replicar los marcadores de ácido nuc1eico comprende amplificar los marcadores de ácido nucleico en una reacción en cadena de polimerasa

15. El método según la reivindicación 11, en que la multiplicidad de primeros y segundos receptores son anticuerpos y la multiplicidad de analitos de ácido no nucleico comprende antígenos, haptenos o una combinación de los mismos.

16. El método según la reivindicación 14, en que la reacción en cadena de polimerasa es una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real.

17. El método según la reivindicación 11, en que uno de la multiplicidad de analitos de ácido no nucleico es PSA.

18. El método según la reivindicación 11, en que la muestra es una muestra de suero y por lo menos uno de la multiplicidad de analitos de ácido no nucleico se encuentra presente en una concentración de menos de 10 picogramos por mililitro.

19. El método según la reivindicación 1, que también comprende:

En la fase (ii) proporcionar un complejo anticuerpo/analito, en que el extremo 5' de un primer ácido nucleico se conjuga al anticuerpo, el analito comprende un antígeno reconocido por el anticuerpo, y el analito se une específicamente al anticuerpo a través del punto de combinación de antígeno del anticuerpo;

En la fase (iii) proporcionar un soporte sólido que comprenda un segundo ácido nucleico, en que el extremo 5' del segundo ácido nuc1eico se une al soporte sólido, en que el segundo ácido nucleico es sustancialmente complementario al primer ácido nucleico sobre su terminal 3';

En la fase (iv) unir el complejo anticuerpo/analito al soporte sólido por medio de un puente de ácido nucleico de doble hebra, en que el puente de ácido nucleico se forma por hibridación de los extremos no unidos del primer y el segundo ácido nucleico; y

En la fase (v) eluir el complejo anticuerpo/analito del soporte sólido por medio de un ácido nucleico desplazador.

20. El método según la reivindicación 1, en que la fase (v) comprende la fase de eluir el complejo informador dependiente de analito de ácido no nucleico/segundo receptor que está fijado a un soporte sólido por medio de un puente de ácido nucleico contactando el complejo informador dependiente de analito/segundo receptor con el ácido nucleico desplazador bajo condiciones que favorecen el desplazamiento del complejo informador dependiente de analito/segundo receptor con el ácido nucleico desplazador.

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