Anticuerpo específico de transferrina deficiente en carbohidratos (CDT), su producción y uso.

Anticuerpo monoclonal, producido mediante inmunización de un animal de ensayo adecuado no humano,

con transferrina deficiente en carbohidratos o transferrina no glicosilada (CDT) y el establecimiento de células de hibridoma, las cuales se unen de manera selectiva en solución acuosa a CDT, sin que éstas necesiten estar ligadas a una fase sólida y cuya unión ocurre en el ámbito de los siguientes segmentos de secuencia (1) a (4) de la CDT:

(1) VVARSMGGKEDLIWELL y

(2) TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF y

(3) SKLSMGSGLNLSEPN y

(4) YEKYLGEEYVKAV.

Anticuerpo específico de transferrina deficiente en carbohidratos (CDT), su producción y uso

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, que se unen de manera selectiva en solución acuosa a un homólogo de transferrina "transferrina deficiente en carbohidratos" (CDT), sin que ésta necesite estar unida a una 5 fase sólida. La CDT se caracteriza porque por lo menos una de las dos cadenas de oligosacáridos, que normalmente están unidas a Asn 413 y/o Asn 611 de la transferrina, está muy ausente o esencialmente muy ausente.

El alcoholismo es un problema difundido mundialmente. En el pasado se desarrolló una serle de pruebas de diagnóstico para diagnosticar alcoholismo. Sin embargo, la mayoría de estas pruebas no es específica para la 10 enfermedad. La prueba más ampliamente desarrollada hasta ahora fue Introducida por Makhlouf et al. en la EP-0 605 627. Los anticuerpos allí divulgados reaccionan de manera específica con CDT, que fue encontrada en alcohólicos, pero sin embargo no en no alcohólicos. Con ello fue posible establecer un inmunoensayo, con cuya ayuda puede detectarse CDT en sueros de alcohólicos. Sin embargo, es una desventaja que en esta prueba el antígeno que va a ser detectado tiene que estar acoplado primero a una fase sólida, puesto que los anticuerpos 15 divulgados en la EP-0 605 627 no se unen o se unen de manera insuficiente a la CDT, la cual se halla en solución.

Con ello, existió el objetivo de mejorar la detección de CDT, de manera que sea posible la detección directa de CDT en una muestra que se encuentra en solución y con ello omitir la necesidad del acoplamiento a una fase sólida del antígeno que va a ser detectado.

De manera sorprendente este objetivo fue logrado mediante el suministro de anticuerpos, que en solución acuosa se 20 unen de manera selectiva a CDT, sin que ésta necesite estar ligada a una fase sólida. Con ayuda de experimentos de levantamiento de mapa de epítope se estableció que los anticuerpos de acuerdo con la invención, en contraposición a los anticuerpos del estado de la técnica, se ligan simultáneamente a diferentes segmentos de secuencia de la CDT. De ello se derivó que los epítopes reconocidos de los anticuerpos de acuerdo con la invención son epítopes discontinuos.

Con ello, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, que en solución acuosa se une de manera selectiva a CDT, sin que ésta necesite estar unida a una fase sólida. Se determinó que la unión de este anticuerpo ocurre en el ámbito de los siguientes segmentos de secuencia (1) a (4) de la CDT:

(1) WARSMGGKEDLIWELL y

(2) TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF y

(3) SKLSMGSGLNLSEPN y

(4) YEKYLGEEYVKAV,

donde es irrelevante si los péptidos están presentes unidos a una fase sólida o en solución.

En el marco de la presente invención, unión selectiva significa una unión suficientemente específica o esencialmente específica, que hace posible una clara diferenciación entre CDT por un lado y transferrina humana por otro lado.

En el sentido de la presente invención, el concepto "fase sólida" o "fase solidificada" abarca un objeto que consiste en un material poroso y/o no poroso, por regla general insoluble en agua y que puede exhibir las más diversas formas, como por ejemplo recipientes, tubos, placas de microtitulación, esferas, micropartículas, palillos, tiras, papel de filtro o de cromatografía, etc. Por regla general, la superficie de la fase sólida es hidrofílica o puede ser convertida en hidrofílica. La fase sólida puede consistir en los más diversos materiales, como por ejemplo en materiales 40 inorgánicos y/u orgánicos, en materiales sintéticos, de ocurrencia natural y/o en materiales de ocurrencia natural modificados. Son ejemplos de materiales de fase sólida polímeros, como por ejemplo celulosa, nitrocelulosa, acetato de celulosa, cloruro de polivinilo, poliacrilamida, moléculas de dextrano entrelazadas, agarosa, poliestireno, polietileno, polipropileno, polimetacrilato o nylon; cerámica; vidrio; metales, en particular metales nobles como oro o plata, magnetita; mezclas o combinaciones de ellos; etc. También el concepto "fase sólida" debería involucrar 45 células, liposomas o vesículas de fosfolípidos.

La fase sólida puede exhibir un recubrimiento de una o varias capas, por ejemplo de proteínas, hidratos de carbono, sustancias lipófilas, biopolímeros, polímeros orgánicos y mezclas de ellos, para suprimir o impedir por ejemplo la unión no específica de componentes de las muestras a la fase sólida o para alcanzar mejoramientos por ejemplo

respecto la estabilidad de la suspensión de fases sólidas en partículas, en la estabilidad al almacenamiento, en la estabilidad a la forma dada o la resistencia frente a la luz UV, microbios u otros agentes con efecto destructor.

Se prefiere el anticuerpo monoclonal, que es producido a partir de un cultivo celular, que fue inscrito ante el DSZM Deutsche Sammlung de Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschero Weg 1b, 38124 Braunschweig, 5 Alemania el 16 de abril de 2002 (día del Ingreso de la posición de inscripción) según acuerdo de Budapest, como sigue:

Cultivo celular 98-84/011 número de ingreso: DSM ACC2540

También son fragmentos de acuerdo con la invención que se ligan al antígeno, por ejemplo fragmentos Fab, Fab, Fv o F(ab)2, que pueden ser producidos a partir de los anticuerpos de acuerdo con la invención previamente 10 mencionados, según métodos conocidos por los expertos.

En general, en el sentido de esta invención, bajo el concepto "anticuerpo" se entiende no sólo anticuerpos completos sino también de manera expresa fragmentos de anticuerpos, como los ya mencionados fragmentos Fab, Fv, F(ab)2 o Fab así como también anticuerpos quiméricos, humanizados, bi- u oligoespecíficos, o "de cadena sencilla"; además también agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas y/o sus fragmentos, en tanto se obtengan 15 las propiedades de unión al antígeno o hapteno. Los fragmentos de anticuerpos se producen por ejemplo mediante escisión enzimática de anticuerpos con enzimas como pepsina o papaína. Los agregados, polímeros y conjugados de anticuerpos pueden ser generados mediante múltiples métodos, por ejemplo mediante tratamiento en caliente, transformación con sustancias como glutaraldehído, reacción con moléculas que se unen a la inmunoglobulina, adición de biotina a anticuerpos y subsiguiente reacción con estreptavidina o avidina, etc.

En el sentido de esta invención, un anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede haber sido producido mediante métodos comunes, por ejemplo mediante inmunización de un animal, como por ejemplo ratón, rata, conejillo de indias, conejo, caballo, oveja, cabra, perro (ver otros Messerschmid (1996) BlOforum, 11:500-502), y subsiguiente establecimiento de células de hibridoma y la subsiguiente purificación de los anticuerpos secretados; o mediante clonación y expresión de las secuencias de nucleótido o bien versiones modificadas de ellas, las cuales 25 codifican las secuencias de aminoácidos que son responsables de la unión del anticuerpo natural al antígeno y/o hapteno.

Además, es un objetivo de la presente invención un método para la producción del anticuerpo mediante Inmunización de un animal de ensayo adecuado con transferrina no glicosilada o CDT, subsiguiente fusión de las células del bazo de este animal de ensayo con células de mieloma, donde surgen células híbridas que producen 30 anticuerpos, y subsiguiente clonación de las células híbridas y selección de un clon de tales células híbridas, el cual produce un anticuerpo, cuya unión ocurre según los resultados de un levantamiento de mapa de epítope en el ámbito de los siguientes fragmentos de secuencia (1) a (4) de una CDT:

(1) VVARSMGGKEDLIWELL y

(2) TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF y

(3) SKLSMGSGLNLSEPN y

(4) YEKYLGEEYVKAV;

Finalmente sigue la producción de los anticuerpos a partir del clon de células híbridas seleccionado de tal manera, según un método conocido por los expertos.

El método de producción previamente descrito comprende la tecnología de hibridoma conocida por todos los 40 expertos para la producción de anticuerpos monoclonales, como fue divulgado por primera vez en el año 1975 por Kóhler y Milstein y después de lo cual fue modificado o mejorado por numerosos autores. Aunque esta tecnología fue empleada frecuentemente para la producción de anticuerpos monoclonales a partir de células de ratón, existen también publicaciones que describen la producción de anticuerpos monoclonales de otro origen. Además, se han divulgado también métodos para la producción de fragmentos de anticuerpos,... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal, producido mediante inmunización de un animal de ensayo adecuado no humano, con

transferrina deficiente en carbohidratos o transferrina no glicosilada (CDT) y el establecimiento de células de hibridoma, las cuales se unen de manera selectiva en solución acuosa a CDT, sin que éstas necesiten estar ligadas 5 a una fase sólida y cuya unión ocurre en el ámbito de los siguientes segmentos de secuencia (1) a (4) de la CDT:

(1) VVARSMGGKEDLIWELL y

(2) TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF y

(3) SKLSMGSGLNLSEPN y

(4) YEKYLGEEYVKAV.

2. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, caracterizado porque él es producido del cultivo celular con el

número de depósito DSM ACC2540.

3. Fragmento que se liga al antígeno de un anticuerpo según una de las reivindicaciones precedentes 1 o 2, el cual exhibe la misma especificidad de antígeno que el anticuerpo definido en una de estas reivindicaciones.

4. Método para la producción del anticuerpo según la reivindicación 1, mediante inmunización de un animal de 15 ensayo no humano adecuado, con transferrina no glicosilada o CDT, fusión de las células del bazo de este animal

de ensayo con células de mieloma, donde surgen células híbridas que producen anticuerpos, clonación de las células híbridas y selección de un clon tal de células híbridas, el cual produce anticuerpo, el cual se une de manera selectiva en solución acuosa a CDT y cuya unión ocurre en el ámbito de los siguientes fragmentos de secuencia (1) a (4) de la CDT:

(1) VVARSMGGKEDLIWELL y

(2) TTEDSIAKIMNGEADAMSLDGGF y

(3) SKLSMGSGLNLSEPN y

(4) YEKYLGEEYVKAV.

5. Inmunoensayo para la detección de CDT en una muestra, caracterizado porque se pone en contacto con la 25 muestra un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 o 2 o el fragmento que se une a un antígeno según la

reivindicación 3 y se determina de manera cualitativa o cuantitativa la formación de un inmunocomplejo que involucra la CDT.

6. Kit de prueba para la ejecución de un inmunoensayo según la reivindicación 5 que contiene un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 o 2 o el fragmento que se une a un antígeno según la reivindicación 3.