Conjugados de proteínas no citotóxicas.

Proteína de fusión de polipéptido monocatenario que comprende:

a. una proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, cuya proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial nociceptor;

b. un resto de reconocimiento que es capaz de unirse a un sitio de unión en el aferente sensorial nociceptor, cuyo sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse a un endosoma contenido en el aferente sensorial nociceptor;

c. un sitio de escisión por proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión se puede escindir mediante una proteasa, en el que el sitio de escisión por la proteasa está ubicado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto de reconocimiento;

d. un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de la proteasa del interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y en el citosol del aferente sensorial nociceptor;

en el que el resto de reconocimiento se ubica entre el sitio de escisión por la proteasa y el dominio de translocación;

y en el que la proteasa (o fragmento de la misma) y el dominio de translocación están separados entre sí por como máximo 100 restos de aminoácidos.

Conjugados de proteínas no citotóxicas

[0001] Esta invención se refiere a proteínas de fusión no citotóxicas, y a las aplicaciones terapéuticas de las mismas como moléculas analgésicas.

[0002] Por lo general, las toxinas se pueden dividir en dos grupos según el tipo de efecto que tienen sobre una célula diana. Con más detalle, el primer grupo de toxinas mata sus células dianas naturales, y por tanto se conocen como moléculas toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas se ejemplifica ínter alia mediante toxinas vegetales como ricina, y abrina, y por toxinas bacterianas como la toxina de la difteria, y la exotoxina A de Pseudomonas. Las toxinas citotóxicas han atraído mucho interés para el diseño de "balas mágicas" (por ejemplo, inmunoconjugados, que comprenden un componente de toxina citotóxica y un anticuerpo que se une a un marcador específico de una célula diana) para el tratamiento de trastornos y dolencias celulares como el cáncer. Las toxinas citotóxicas matan típicamente sus células diana al inhibir los procesos celulares de la síntesis de proteínas.

[0003] El segundo grupo de toxinas, que se conocen como toxinas no citotóxicas no matan (como su nombre confirma) sus células dianas naturales. Las toxinas no citotóxicas han atraído mucho menos interés comercial que sus equivalentes citotóxicas, y ejercen su efecto sobre una célula diana por inhibición de procesos celulares distintos a la síntesis de proteínas. Las toxinas no citotóxicas se producen por diferentes plantas y por diferentes microorganismos, tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.

[0004] Las neurotoxinas clostrídicas son proteínas que típicamente tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. Son producidas por diferentes especies de bacterias, especialmente del género Clostridium, de forma más importante C. tetani y varias cepas de C. botulinum, C. butyñcum y C. argentinense. En la actualidad existen ocho clases diferentes de las neurotoxinas clostrídicas, concretamente: toxina tetánica, y toxina botulínica en sus serotipos A, B, C1, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modos de acción similares.

[0005] Las neurotoxinas clostrídicas representan un grupo principal de moléculas toxinas no citotóxicas, y se sintetizan por la bacteria hospedadora en forma de polipéptidos simples que se modifican post-traduccionalmente mediante un episodio de escisión proteolítica para formar dos cadenas polipeptídicas unidas entre sí por un puente disulfuro. Las dos cadenas se denominan la cadena pesada (cadena H), que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L), que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa.

[0006] Las cadenas L tienen una función proteasa (actividad endopeptidasa dependiente de cinc) y muestran una elevada especificidad de sustrato para las proteínas asociadas a vesículas y/o membrana plasmática implicadas en el proceso exocítico. Las cadenas L procedentes de diferentes especies o serotipos clostridiales pueden hidrolizar enlaces peptídicos diferentes pero específicos en tres proteínas sustrato, concretamente sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.

[0007] Neisseria sp., principalmente de la especie N. gonorrhoeae, produce proteasas no citotóxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de una proteasa de ese tipo es un proteasa IgA (consultar el documento W099/58571).

[0008] Está bien documentado en la técnica que las moléculas toxinas se pueden redirigir a una célula que no sea la célula diana natural de la toxina. Cuando se redirigen, la toxina modificada es capaz de unirse a una célula diana deseada y, tras la translocación posterior en el citosol, es capaz de ejercer su efecto sobre las células diana. Dicho redireccionamiento se consigue al sustituir el Resto de Direccionamiento (TM) natural de la toxina por un TM diferente. A este respecto, el TM se selecciona de forma que se unirá a la célula diana deseada, y permitirá el paso posterior de la toxina modificada a un endosoma contenido en la célula diana. La toxina modificada comprende también un dominio de translocación que permite la entrada de la proteasa no citotóxica al citosol de la célula. El dominio de translocación puede ser el dominio de translocación natural de la toxina o puede ser un dominio de translocación diferente obtenido a partir de una proteína microbiana con actividad de translocación.

[0009] Por ejemplo, el documento W094/21300 describe moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que son capaces de regular la densidad de Proteína Integral de Membrana (IMP) en la superficie celular de la célula diana. Las moléculas de neurotoxina modificadas son por tanto capaces de controlar la actividad celular (por ejemplo, la recaptación de glucosa) de la célula diana. Los documentos W096/33273 y WO99/17806 describen moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que se dirigen a aferentes sensoriales periféricos. Las moléculas modificadas de neurotoxina son por tanto capaces de demostrar un efecto analgésico. El documento WO00/10598 describe la preparación de moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que se dirigen a células hipersecretoras de moco (o a las células neuronales que controlan dichas células hipersecretoras de moco), dichas neurotoxinas modificadas son capaces de inhibir la hipersecreción procedente de dichas células. El documento WO01/21213

describe moléculas modificadas de neurotoxina clostrídica que se dirigen a una amplia gama de tipos diferentes de células diana no neuronales. Las moléculas modificadas son por tanto capaces de evitar la secreción desde las células diana. Otras publicaciones en el campo técnico de las moléculas de toxina redirigida incluyen los documentos: WOOO/62814; WO00/04926; US5.773.586; W093/15766; WOOO/61192; y W099/58571.

[0010] La sustitución de TM anteriormente mencionada puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales de conjugación química, que son bien conocidas del experto en la técnica. A este respecto, se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of proteln conjugation and cross-llnking, CRC Press.

[0011] Sin embargo, la conjugación química a menudo es imprecisa. Por ejemplo, tras la conjugación, un TM puede quedar unido a lo que resta de conjugado en más de un sitio de unión.

[0012] La conjugación química también es difícil de controlar. Por ejemplo, un TM puede quedar unido a lo que resta de la toxina modificada en un sitio de unión del componente de proteasa y/o en el componente de translocación. Esto es un problema cuando se desea solo la unión a uno de dichos componentes (preferiblemente en un único sitio) para conseguir eficiencia terapéutica.

[0013] De este modo, la conjugación química da como resultado una población mixta de moléculas de toxina modificada, lo que es indeseable.

[0014] Como alternativa a la conjugación química, la sustitución de TM se puede llevar a cabo por preparación de una proteína de fusión de un único polipéptido (consultar el documento WO98/07864). Esta técnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo por el cual se prepara la neurotoxina clostrídica natural (es decir, la holotoxina) y el resultado es una proteína de fusión que tiene la siguiente disposición estructural:

NH2 - [componente de proteasa] - [componente de translocación] - [TM] - COOH

[0015] Según el documento WO98/07864, el TM se coloca hacia el extremo C de la proteína de fusión. La proteína de fusión se activa a continuación por tratamiento con una proteasa, se escinde en un sitio entre el componente de proteasa y el componente de translocación. De este modo se produce una proteína bicatenaria, que comprende el componente de proteasa como una cadena de polipéptido simple unido covalentemente (mediante un puente disulfuro) a otra cadena de polipéptido simple que contiene el componente de translocación y el TM. Aunque la metodología del documento WO98/07864 sigue (en términos de disposición estructural de la proteína de fusión) el sistema de expresión natural de la holotoxina clostrídica, los presentes inventores han encontrado que este sistema puede dar como resultado la producción de algunas proteínas de fusión que tienen una capacidad de unión sustancialmente reducida por la célula diana pretendida.

[0016] El documento US5989545 describe derivados de la toxina clostrídica.

[0017] El documento WO 2004/024909 describe fragmentos de toxina.

[0018] El documento EP1422240 describe análogos de nociceptina.

[0019] Por tanto, existe la necesidad de un sistema alternativo o mejorado para construir... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión de polipéptido monocatenario que comprende:

a. una proteasa no citotóxica, o un fragmento de la misma, cuya proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial noclceptor;

b. un resto de reconocimiento que es capaz de unirse a un sitio de unión en el aferente sensorial noclceptor, cuyo sitio de unión es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse a un endosoma contenido en el aferente sensorial nociceptor;

c. un sitio de escisión por proteasa en cuyo sitio la proteína de fusión se puede escindir mediante una proteasa, en el que el sitio de escisión por la proteasa está ubicado entre la proteasa no citotóxica o fragmento de la misma y el resto de reconocimiento;

d. un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o fragmento de la proteasa del Interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y en el citosol del aferente sensorial noclceptor;

en el que el resto de reconocimiento se ubica entre el sitio de escisión por la proteasa y el dominio de translocación; y en el que la proteasa (o fragmento de la misma) y el dominio de translocación están separados entre sí por como máximo 100 restos de aminoácidos.

2. Proteína de fusión, según la reivindicación 1, en la que el resto de reconocimiento y el sitio de escisión por la proteasa están separados por como máximo 10 restos de aminoácidos, preferiblemente por como máximo 5 restos de aminoácidos y más preferiblemente por como máximo cero restos de aminoácidos.

3. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que proteasa no citotóxica es una cadena L de la toxina clostrídica o una proteasa IgA.

4. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de translocaclón es el dominio Hn de una neurotoxina clostrídica.

5. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el resto de reconocimiento comprende como máximo 50 restos de aminoácidos, preferiblemente como máximo 40 restos de aminoácidos, más preferiblemente como máximo 30 restos de aminoácidos, y lo más preferiblemente como máximo 20 restos de aminoácidos.

6. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el resto de reconocimiento:

(i) es un opioide;

(¡i) es un agonista de un receptor presente en el aferente sensorial nociceptor, preferiblemente en el que el resto de reconocimiento es un agonista de un receptor presente en un aferente sensorial nociceptor primario;

(¡ü) se une al receptor ORL-i, preferiblemente en el que el resto de reconocimiento se une específicamente al receptor ORL-i, más preferiblemente en el que el resto de reconocimiento es un agonista del receptor ORL-i.

7. Proteína de fusión, según la reivindicación 6, en la que el resto de reconocimiento tiene una identidad en la secuencia de aminoácidos de al menos un 70% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma, o en la que el resto de reconocimiento tiene una identidad en la secuencia de aminoácidos de al menos un 80% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma, o en la que el resto de reconocimiento tiene una identidad en la secuencia de aminoácidos de al menos un 90% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma, o en la que el resto de reconocimiento tiene una identidad en la secuencia de aminoácidos de al menos un 95% respecto de la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma, o en la que el resto de reconocimiento es la SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma, o en la que el resto de reconocimiento es una de las SEQS ID NO: 40, 42, 44, 46, 48 o 50, o en la que el resto de reconocimiento es un nociceptina.

8. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el resto de reconocimiento se selecciona del grupo que consiste en nociceptina, (3-endorfina, endomorfina-1, endomorf¡na-2, dinorfina, met- encefalina, leu-encefalina, galanina, y péptido PAR-2.

9. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación; preferiblemente, en la que la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación, que está presente en el extremo N y/o en el extremo C de la proteína de fusión; más preferiblemente, en la que la etiqueta de purificación está unida a la proteína de fusión mediante una molécula peptídlca separadora.

10. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de translocaclón está separado del resto de reconocimiento por una molécula peptídica separadora.

11. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. Vector de ADN, que comprende un promotor, una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 11, en el que dicha secuencia de ADN se ubica en dirección 3 del promotor, y un terminador se ubica en dirección 3 de la construcción de ADN.

13. Procedimiento para preparar una proteína de fusión de polipéptido monocatenario, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende expresar una secuencia de ácido nucleico, según la reivindicación 11, o un vector de ADN, según la reivindicación 12, en una célula hospedadora.

14. Procedimiento para preparar un agente no citotóxico, que comprende:

a. poner en contacto una proteína de fusión de polipéptido monocatenario, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, con una proteasa capaz de escindir el sitio de escisión por la proteasa;

b. escindir el sitio de escisión por la proteasa; y formar de esta manera una proteína de fusión bicatenaria.

15. Un polipéptido no citotóxico, que se puede obtener según el procedimiento de la reivindicación 14, en el que el polipéptido es un polipéptido bicatenario, y en el que:

a. la primera cadena comprende la proteasa no citotóxica, o fragmento de la misma, cuya proteasa o fragmento de proteasa es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica de un aferente sensorial nociceptor;

b. la segunda cadena comprende el TM y el dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa o el fragmento de proteasa del interior de un endosoma, a través de la membrana endosómica y en el citosol del aferente sensorial nociceptor; y

la primera y segunda cadenas estás unidas por enlace disulfuro.

16. Uso de una proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o un polipéptido según la reivindicación 15, en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o aminorar el dolor; preferiblemente cuando el dolor es dolor crónico.

17. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o un polipéptido según la reivindicación 15, para uso en el tratamiento, prevención o para aminorar el dolor;

preferiblemente cuando el dolor es dolor crónico.