Composiciones para la preparación de células dendríticas maduras.

Un método para la maduración in vitro de al menos una célula dendrítica inmadura,

que comprende estimular dicha célula dendrítica inmadura con TNFα, IL-1β, IFNγ, un agonista de TLR7/8 y prostaglandina E2 (PG).

Composiciones para la preparación de células dendríticas maduras La invención se refiere a nuevas composiciones para la preparación de células dendríticas maduras, así como a métodos para la maduración in vitro de células dendríticas inmaduras y a los usos terapéuticos de las células dendríticas que se pueden obtener por el método de la invención.

Las células dendríticas (de aquí en adelante DC por la expresión inglesas Dentritic Cells) tienen un alto potencial en un paciente como adyuvantes en la inducción de células asesinas y auxiliares específicas de tumores (Schuler G, Schuler-Thurner B, Steinman RM. The use of dendritic cells in cancer immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 2003 Apr; 15 (2) : 138-47. Review. Banchereau J, Palucka AK. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat. Rev. Immunol. 2005 Apr; 5 (4) :296-306. Review. Salcedo M, Bercovici N, Taylor R, Vereecken P, Massicard S, Duriau D, Vernel-Pauillac F, Boyer A, Baron-Bodo V, Mallard E, Bartholeyns J, Goxe B, Latour N, Leroy S, Prigent D, Martiat P, Sales F, Laporte M, Bruyns C, Romet-Lemonne JL, Abastado JP, Lehmann F, Velu T. Vaccination of melanoma patients using dendritic cells loaded with an allogeneic tumor cell lysate. Cancer Immunol. Immunother. 2005 Sep 27:1-11 [En edición electrónica antes que impresa]) .

Para este fin, las células dendríticas maduras que han sido maduradas in vitro a partir de células dendríticas inmaduras procedentes de un paciente, se cargan con antígenos específicos de tumores y se vuelven a inyectar en el organismo, preferiblemente en los ganglios linfáticos o en su proximidad. En el interior de los ganglios linfáticos las células dendríticas interaccionan con los linfocitos T naturales dando como resultado la transducción de señales activas durante la llamado sinapsis inmunológica y la subsiguiente proliferación de linfocitos T efectores, que a su vez median las respuestas antitumorales como la citotoxicidad (linfocitos T citotóxicos = CTL) , la activación de macrófagos y las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado. Las DC regulan las polarizaciones de los linfocitos T auxiliares (h) CD4+. Los linfocitos Th1, por ejemplo, mantienen los CTL por secreción de ciertos patrones de citoquinas (por ejemplo, interferón gamma e IL-2, TNF-beta) . Por otro lado, los linfocitos Th2 inducen anticuerpos así como eosinófilos y la desgranulación de los mastocitos por IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Langenkamp A, Messi M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming of Th1, Th2 and nonpolarized T cells. Nat. Immunol. 2000 Oct; 1 (4) :311-6, O'Gara, A: Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T helper cell subsets. Immunity 1998, 8: 275-283, Rengarajan J, Szabo SJ, Glimcher LH. Transcriptional regulation of Th1/Th2 polarization. Immunol. Today. 2000 Oct; 21 (10) :479-83. Review) .

Para la terapia con células dendríticas, es esencial que esté disponible un número suficiente de CD principales. Puesto que, en un paciente, sólo el 0, 2% de los leucocitos son células dendríticas, es necesario disponer de un método eficaz para la producción in vitro de células dendríticas maduras.

En la técnica, se han propuesto varios métodos para la preparación de células dendríticas maduras a partir de células mononucleares de sangre periférica, monocitos u otras células progenitoras mieloides (Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, Steinbrink K, Paragnik L, Schmitt E, Knop J, Enk AH.: Pro-inflammator y cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulator y dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 1997 Dec; 27 (12) :3135-42) . Mosca PJ, Hobeika AC, Clay TM, Nair SK, Thomas EK, Morse MA, Lyerly HK. A subset of human monocyte-derived dendritic cells expresses high levels of interleukin-12 in response to combined CD40 ligand and interferon-gamma treatment. Blood. 2000 Nov 15; 96 (10) :3499-504. Mailliard RB, Wankowicz-Kalinska A, Cai Q, Wesa A, Hilkens CM, Kapsenberg ML, Kirkwood JM, Storkus WJ, Kalinski P.: Alpha-type-1 polarized dendritic cells: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity. Cancer Res. 2004 Sep 1;64 (17) :5934-7. Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, Sallusto F, Lanzavecchia A.: Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005 Aug; 6 (8) :769-76. Epub 2005 Jul 3. 2005 Aug; 6 (8) :769-76. 2005. Gautier G, Humbert M, Deauvieau F, Scuiller M, Hiscott J, Bates EE, Trinchieri G, Caux C, Garrone P.: A type I interferon autocrine-paracrine loop is involved in Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by dendritic cells. J. Exp. Med. 2005 May 2; 201 (9) :1435-46. 2005) .

Se acepta que el cultivo de células mononucleares de sangre periférica, monocitos u otras células progenitoras mieloides con GM-CSF y con IL-4 o IL-13 da como resultado la producción in vitro de células dendríticas inmaduras (Ahn JS, Agrawal B. IL-4 is more effective than IL-13 for in vitro differentiation of dendritic cells from peripheral blood mononuclear cells. Int. Immunol. 2005 Oct; 17 (10) :1337-46. Epub 2005 Sep 2) . Sin embargo, hasta la fecha, no existe ningún método satisfactorio disponible para la maduración de las células dendríticas inmaduras. Jonuleit H. et al., (1997, supra) describen un proceso de maduración utilizando una composición que comprende TNF-, IL-1, IL-6 y la prostaglandina E2 (PG) (el denominado cóctel de Jonuleit) . Las células dendríticas producidas por incubación de células dendríticas inmaduras con esta composición muestran los marcadores de superficie de células dendríticas maduras y pueden ser así recolectadas. Sin embargo, estas células no producen IL-12p70 activa biológica, que es el factor más importante para la inducción de células Th1 en los ganglios linfáticos.

Mailliard, R. et al., describen una composición que comprende TNF-, IL-1, interferón , interferón y poli (I:C) (Mailliard, R. et al., 2004, supra.) . En contraste con el cóctel de Jonuleit anterior, la incubación de células dendríticas inmaduras con este cóctel llamado de Kalinski da como resultado células dendríticas maduras (como se demuestra por los marcadores de superficie respectivos) , que producen IL-12p70. Sin embargo, estas células son muy

adherentes al fondo de los matraces de cultivo y son, por lo tanto, casi imposibles de recolectar. Es, por lo tanto, muy difícil, si no imposible, obtener con este método células dendríticas maduras suficientes para la terapia de vacunación.

El documento WO 00/47719 describe un compuesto (R848) que se propone para la preparación de células dendríticas maduras. En los experimentos descritos en esta solicitud, las células dendríticas inmaduras son estimuladas sólo con R848. Sin embargo, R848 como la única sustancia de maduración no es capaz de proporcionar todas las características adecuadas para las células dendríticas clínicas. Todos los experimentos se han llevado a cabo con suero fetal de ternera (FCS) y, por lo tanto, no aplicable en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) debido a que las condiciones libres de suero fetal de ternera son cruciales para un proceso de GMP.

Por lo tanto, se necesitan todavía métodos mejorados para la preparación de células dendríticas maduras a partir de células dendríticas inmaduras.

La invención proporciona un método para la maduración in vitro de al menos una célula dendrítica inmadura, que comprende estimular dicha célula dendrítica inmadura con TNF-, IL-1ß, IFN, un agonista de TLR7/8 y prostaglandina E2 (PG) .

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la combinación de TNF-, IL-1ß, IFN, un agonista de TLR7/8 y prostaglandina E2 (PG) es especialmente adecuada para promover la maduración in vitro de células dendríticas. Especialmente, y como se demuestra en el Ejemplo, las células dendríticas maduras obtenidas utilizando dicha combinación expresan sorprendentemente IL-12p70 en cantidades considerables y son sorprendentemente fáciles de recolectar, lo que permite obtener células dendríticas maduras en cantidades considerables. Dichas poblaciones de células dendríticas maduras no pudieron ser producidas con los cócteles conocidos en la técnica, y especialmente no con el cóctel de Jonuleit ni con el cóctel de Kalinski, como se explicó anteriormente.

Los métodos individuales para la preparación de las células dendríticas maduras, por ejemplo, a partir de células mononucleares de sangre periférica humana, monocitos u otras células progenitoras mieloides, y de las mismas DC inmaduras, que han sido aisladas directamente de la sangre, son conocidos en la técnica... [Seguir leyendo]

1. Un método para la maduración in vitro de al menos una célula dendrítica inmadura, que comprende estimular dicha célula dendrítica inmadura con TNF, IL-1ß, IFN, un agonista de TLR7/8 y prostaglandina E2 (PG) .

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además estimular dicha célula dendrítica inmadura con un 5 agonista de TLR3, preferiblemente poli (I:C) .

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dichas sustancias son parte de una composición añadida al medio de cultivo de dicha célula dendrítica inmadura.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho agonista de TLR7/8 es un compuesto modificador de la respuesta inmunitaria de tipo imidazoquinolina, preferiblemente en el que dicho compuesto

modificador de la respuesta inmunitaria de tipo imidazoquinolina es 4-amino-2-etoximetil-, -dimetil-1Himidazol[4, 5-c]quinolina-1-etanol (R848) .

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha célula dendrítica inmadura es una célula dendrítica inmadura derivada de monocitos, preferiblemente derivada de células mononucleares de sangre periférica humana, monocitos, otras células progenitoras mieloides, o de células progenitoras CD34+, por diferenciación in vitro a células CD14+, o en donde dicha célula dendrítica inmadura se obtiene directamente a partir de sangre periférica.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula dendrítica inmadura se obtiene incubando células mononucleares de sangre periférica humana, monocitos u otras células progenitoras mieloides con GM-CSF e IL-4 o IL-13.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula dendrítica inmadura es de origen humano.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar células mononucleares a partir de sangre periférica, preferiblemente en donde dichas células mononucleares se obtienen por leucoféresis de sangre periférica, b) incubar las células mononucleares de la etapa a) con GM-CSF e IL-4 o IL-13, preferiblemente en donde dicha incubación dura de 1 a 9, preferiblemente de 2 a 9, más preferiblemente de 2 a 6 días, c) incubar las células obtenidas en la etapa b) con un cóctel que comprende TNF, IL-1ß, IFN, un agonista de TLR7/8, prostaglandina E2 (PG) y, opcionalmente, un agonista de TLR3, preferiblemente poli (I:C) , en donde dicha incubación dura 12 horas a 72 horas, preferiblemente 20 horas o 24 horas, y d) recolectar la célula o células dendríticas maduras.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la célula o células dendríticas maduras se cargan además in vitro con uno o más antígenos, preferiblemente en donde dicho antígeno o antígenos se supone que provocan la maduración de linfocitos T efectores dentro de los ganglios linfáticos, más preferiblemente en donde dicha carga se realiza incubando la célula o células dendríticas maduras con al menos un péptido de dicho antígeno o transfectando la célula o células dendríticas con RNA o DNA que codifica el antígeno.

10. Una población de células dendríticas maduras, obtenibles por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 o 9, en donde la célula dendrítica inmadura es de origen humano y en donde TNF se usa a una concentración de 1 ng/mL a 50 ng/mL, IL-1ß se usa a una concentración de 1 ng/mL a 50 ng/mL, IFN se usa a una concentración de 500 U/mL a 10.000 U/mL, el agonista de TLR7/8 se usa a una concentración de 0, 2 µg/mL a 5 µg/mL, PGE2 se usa a una concentración de 50 ng/mL a 5000 ng/mL y el agonista de TLR3 se usa a una concentración de 10 ng/mL a 50 ng/mL.

11. Una composición farmacéutica que comprende la población de células dendríticas maduras de la reivindicación 10.

12. La población de células dendríticas maduras de la reivindicación 10, para uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades oncogénicas y enfermedades infecciosas.

13. Un uso in vitro combinado de TNF, IL-1ß, IFN, un agonista de TLR7/8, prostaglandina E2 (PG) y, opcionalmente, un agonista de TLR3, preferiblemente poli (I:C) , para la preparación de al menos una célula dendrítica madura.

14. El uso de la reivindicación 13, en donde dicho agonista de TLR7/8 es un compuesto modificador de la respuesta inmunitaria de tipo imidazoquinolina, preferiblemente 4-amino-2-etoximetil-, -dimetil-1Himidazol[4, 5-c]quinolina-1-etanol (R848) .

15. Una composición que comprende TNF, IL-1ß, IFN, un agonista de TLR7/8, prostaglandina E2 (PG) y, opcionalmente, un agonista de TLR3, preferiblemente poli (I:C) , en donde preferiblemente dicho agonista de TLR7/8 es un compuesto modificador de la respuesta inmunitaria de tipo imidazoquinolina, preferiblemente 4amino-2-etoximetil-, -dimetil-1H-imidazol[4, 5-c]quinolina-1-etanol (R848) .