Gen KASPP(LRRK2) , su producción y uso para la detección y tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

(a) los nucleótidos 1 a 9104 de la SEQ ID NO: 1;

(b) los nucleótidos 1 a 7584 de la SEQ ID NO: 1;

(c) los nucleótidos 1 a 7581 de la SEQ ID NO: 1;

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1;

(e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d); y / o

(f) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c), o (d) que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1 o que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (e) .

Gen KASPP (LRRK2) , su producción y uso para la detección y tratamiento de trastornos neurodegenerativos

La presente invención se refiere a un gen recientemente descubierto llamado KASPP por quinasa asociada con el parkinsonismo con patología pleomórfica o alternativamente llamado LRRK2 por quinasa 2 con repeticiones ricas en leucina, su producción, caracterización bioquímica y uso para la detección y tratamiento de trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en inglés) , que incluye, sin limitación, PD esporádica, la enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en inglés) , esclerosis lateral amiotrófica (ALS por sus siglas en inglés) , y otras sinucleinopatías y/o tauopatía.

La enfermedad de Parkinson (PD) es el segundo trastorno más neurodegenerativo que afecta a 1 - 2% de la población mayor de 65 años y se caracteriza por una pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, asociada con la formación de agregados fibrilares compuestos de proteína a-sinucleína y otras proteínas (cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy) . En la mayoría de los casos, la PD se presenta como una enfermedad esporádica de etiología desconocida, pero en raras ocasiones, las mutaciones puntuales o multiplicaciones del gen de la a-sinucleína pueden causar parkinsonismo autosómico dominante que se asemeja a la enfermedad esporádica en muchos aspectos. Se han reconocido formas recesivas de parkinsonismo, que son causadas por mutaciones en los genes para parkin (Kitada T. et al., Nature, 392, 605 - 608, 1998) , DJ-1 (Bonifati V. et al., Science, 299, 256 - 259, 2002) y PINK1 (Valente E. M. et al., Science, 304 (5674) , 1158 - 1160, 2004) . Se han mapeado loci adicionales en cromosomas 2p (Gasser T. et al., Nat. Genet., 18, 262 - 265, 1998) , 12cen (Funayama

M. et al., Ann. Neurol., 51 (3) , 296 - 301, 2002) , 1q (Hicks A. A. et al., Ann. Neurol., 52 (5) , 549 - 555, 2002) , y 2q (Pankratz N. et al., Am. J. Hum. Genet., 72 (4) , 1053 - 1057, 2003) . En más del 10% de los pacientes con PD uno o más parientes también son afectados por este trastorno (Elbaz et al., Neurology, 52: 1876 - 82, 1999) . Sin embargo, las causas genéticas se encuentran sólo muy raramente.

Ya que la agregación de a-sinucleína es una característica patológica tanto en la forma esporádica común como en una forma heredada dominante de la PD, y también en otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la demencia con cuerpos de Lewy (DLB por sus siglas en inglés) y la atrofia multisistémica (MSA por sus siglas en inglés) , esas enfermedades han sido llamadas colectivamente como "sinucleinopatías". Otras formas de parkinsonismo están asociadas con la acumulación de filamentos compuestos de la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT por sus siglas en inglés) . Las mutaciones en este gen explican al menos un subgrupo de familias con demencia frontotemporal con parkinsonismo (FTDP-17; Ghetti B. et al., "La demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 asociado con mutaciones del gen tau (FTDP-17) ". En: Dickson D. W., "Neurodegeneration: the molecular pathology of dementia and movement disorders" ISN Neuropath Press, Basal, 86

- 102, 2003) , mientras que los casos esporádicos con patología tau más comúnmente presentes como parálisis supranuclear progresiva (PSP por sus siglas en inglés) o la degeneración corticobasal (CBD por sus siglas en inglés) . Con base en el papel central putativo de la proteína tau en estas enfermedades, han sido llamadas "tauopatías".

Recientemente se ha demostrado que dos grandes familias con aparición tardía de parkinsonismo autosómico dominante (familias A y D) están vinculadas al locus de PARK8 en el cromosoma 12p11.2-q13.1 (0MIM # 607060) , originalmente mapeado en una familia japonesa por Funayama et al. (Funayama et al., Ann. Neurol, 51 (3) , 296 - 301, 2002; Zimprich A. et al., Am. J. Hum. Genet., 74 (1) , 11 - 19, 2004) .

Ahora, un análisis de haplotipos refinó la región candidata a un intervalo de 13 Mb entre los marcadores flanqueadores D12S1692 y D12S85. Un total de 29 genes han sido secuenciados en esa región en dos pacientes de cada familia (véase la Tabla 1) .

Un gen completo, parte de cual había sido previamente depositado bajo la referencia DKFZp434H211 (Número de acceso: XM_058513) , ha sido amplificado a partir de ADNc de cerebro humano utilizando cebadores superpuestos correspondientes a las secuencias publicadas de diferentes EST y ARNm. Sin embargo, se hizo evidente a partir de las alineaciones de secuencias de especies cruzadas que el clon DKFZp434H211 estaba incompleto hacia el extremo 5'.

Sorprendentemente, se han encontrado varias mutaciones, incluyendo mutaciones sin sentido y una mutación del sitio de empalme, en el gen grande recientemente descubierto que codifica para una proteína multifuncional, que se denomina como quinasa asociada con parkinsonismo con patología pleomórfica, KASPP. KASPP abarca una región genómica de 144 Kb y comprende 51 exones y codifica 2527 aminoácidos (véanse las SEQ ID NOS: 1 y 2 y la Fig. 4) . El gen también puede ser llamado Z, quinasa 2 con repeticiones ricas en leucina, LRRK2, ya que es el único gen en el genoma humano que codifica una quinasa que contiene repeticiones ricas en leucina, lo cual era muy sorprendente. KASPP/LRRK2 es una proteína de 285 kD.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de:

(a) los nucleótidos 1 a 9104 de la SEQ ID NO: 1;

(b) los nucleótidos 1 a 7584 de la SEQ ID NO: 1;

(c) los nucleótidos 1 a 7581 de la SEQ ID NO: 1;

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1;

(e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) o (d) ; y/o

(f) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

La SEQ ID NO: 2 refleja la secuencia de aminoácidos de KASPP/LRRK2 humana y la secuencia humana de nucleótidos que codifica para la KASPP/LRRK2 humana.

Los ejemplos de polinucleótidos seleccionados del párrafo (f) anterior, son las mutaciones específicas, las variantes y los polimorfismos descritos en la presente memoria.

Un polimorfismo en general es la aparición de diferentes formas de ácidos nucleicos o proteínas en organismos individuales o en organismos de la misma especie, independiente de las variaciones sexuales. De acuerdo con la presente invención, se han encontrado dos polimorfismos diferentes para la KASPP/LRRK2 humana. Una muestra una variación de citosina por timidina en la posición 635 (c635t) causando un cambio en la secuencia de aminoácidos de serina por leucina (S212L) (véanse las SEQ ID NOS: 4 y 5) . La otra muestra una variación de timidina por citosina en la posición 7190 que causa un cambio en la secuencia de aminoácidos de metionina por treonina (M2397T) (véanse las SEQ ID NOS: 6 y 7) .

Ejemplos de condiciones de hibridación de alta rigurosidad se pueden encontrar por ejemplo, en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wily & Sons, Inc., Nueva York, NY (1989) . En un ejemplo particular, un filtro, por ejemplo un filtro de nitrocelulosa, se incuba durante la noche a 68 º C con una sonda en una solución de hibridación que contiene por ejemplo formamida al 50%, alta en sal (ya sea 5x SSC [2Ox: NaCl 3 M/citrato trisódico 0, 3 M] o 5x SSPE [2Ox: NaCl 3, 6 M / NaH2PO4 0, 2M / EDTA 0, 02M, pH 7, 7]) , solución de Denhardt 5x, SDS al 1%, y 100 μg / ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Esto es seguido por varios lavados con amortiguador, por ejemplo, en 0, 2x SSC / SDS al 0, 1% a una temperatura seleccionada con base en la rigurosidad deseada y la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN. Por ejemplo, 68 ºC son adecuados para la hibridación de alta rigurosidad.

La presente invención también está dirigida a un fragmento de la molécula de ácido nucleico de la invención especificada anteriormente, que contiene al menos uno de los 51 exones y / o que codifica al menos uno de los cinco dominios como se especifica en la Figura 4, la Figura 5 y / o la Figura 11 y / o la presente memoria descriptiva. Los límites de los exones como se especifica en la Figura 4 son aplicables para las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

Además, la molécula de ácido nucleico como se especifica en (f) más arriba puede consistir de 10 a 50 nucleótidos, preferiblemente de 10 a 35 nucleótidos,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de:

(a) los nucleótidos 1 a 9104 de la SEQ ID NO: 1;

(b) los nucleótidos 1 a 7584 de la SEQ ID NO: 1;

(c) los nucleótidos 1 a 7581 de la SEQ ID NO: 1;

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1;

(e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) o (d) ; y / o

(f) una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) , (c) , o (d) que codifica para la secuencia de la proteína de la SEQ ID NO: 1 o que hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (e) .

2. Un vector, preferiblemente un vector de expresión, que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación

1.

3. Una célula que contiene el vector de la reivindicación 2.

4. Un animal transgénico no humano que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 2.

5. Una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1.

6. La proteína de acuerdo con la reivindicación 5 que contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

7. Un método para producir la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, comprendiendo el método:

(a) cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 3 bajo condiciones adecuadas; y

(b) aislar la proteína producida por la célula cultivada.

8. Un kit de diagnóstico que contiene al menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 1 para el diagnóstico de una enfermedad neuronal, en particular un trastorno neurodegenerativo, especialmente enfermedad de Parkinson (PD) , incluyendo PD esporádica, enfermedad de Alzheimer (AD) , esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , sinucleinopatía y / o tauopatía, en combinación con auxiliares adecuados.

9. Una composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 1 o una proteína como la definida en la reivindicación 5 y 6.

10. El uso de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o de una proteína como se define en la reivindicación 5 y 6 para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo, especialmente enfermedad de Parkinson (PD) , incluyendo la PD esporádica, AD, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , sinucleinopatía y/o tauopatía, en combinación con auxiliares adecuados.

11. Un método para el cribado de un agente farmacéutico o de diagnóstico, comprendiendo el método:

(a) proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 o una proteína tal como se definen en la reivindicación 5 y 6,

(b) proporcionar un compuesto de prueba, y

(c) medir o detectar la influencia del compuesto de prueba sobre la actividad de la expresión de la molécula de ácido nucleico o la proteína.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde se provee el compuesto de prueba en la forma de una biblioteca de compuestos químicos.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde la influencia del compuesto de prueba se mide o se detecta en un ensayo heterogéneo u homogéneo.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

11. 13, en donde el método se lleva a cabo en una matriz.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

11. 14, en donde el método se lleva a cabo utilizando células enteras.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

11. 15, en donde el método se lleva a cabo en un 10 sistema robótico.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

11. 16, en donde el método se lleva a cabo mediante microfluídos.

18. Un anticuerpo o derivado de anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6.