Vacunas basadas en el uso de VMA.

Un medicamento que incluye un equipo de partes que comprende los siguientes componentes:

a) un primer componente que comprende una o más proteínas extrañas o un ácido nucleico que codifica las mismas o partes funcionales de las mismas, cuyas partes funcionales contienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje; y

b) un segundo componente que comprende un Virus Vacuna Modificado de Ankara (VMA), que transporta una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende:

- ubiquitina o una parte funcional de la misma, cuya parte funcional contiene una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje; y

- una o más proteínas extrañas, es decir, una o más proteínas que no están presentes de modo natural como una parte del VMA o partes funcionales de las mismas, cuya parte funcional comprende una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje;

en el que la una o más proteínas extrañas son las mismas en a) y b), y

en el que los primeros y segundos componentes comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Vacunas basadas en el uso de VMA

La presente invención está en el campo de vacunas basadas en el virus vacuna modificado de Ankara recombinante (MV) .

El virus vacuna (VV) pertenece al género Orthopoxvirus de la familia poxvirus. Ciertas cepas del virus vacuna se han usado durante muchos años como una vacuna viva para inmunizar contra la viruela, por ejemplo la cepa Elstree del Instituto Lister en el Reino Unido. Debido a las complicaciones que pueden derivar de la vacunación (SchÃr, Zeitschr. für PrÃventivmedizin 18, 41-44 [1973]) , y debido a la declaración en 1980 de la OMS de que la viruela se había erradicado, actualmente sólo se vacuna contra la viruela a personas en alto riesgo.

Los virus vacunas también se han usado como vectores para la producción y entrega de antígenos extraños (Smith y col., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407 [1984]) . Esto implica secuencias de ADN (genes) que codifican los antígenos extraños que se están introduciendo, con la ayuda de técnicas de recombinación de ADN, en el genoma de los virus vacunas. Si el gen se integra en un lugar en el ADN vírico que no es esencial para la vida del ciclo, es posible que el virus vacuna recombinante recién producido sea infeccioso, es decir, que sea capaz de infectar células extrañas y de este modo expresar la secuencia integrada de ADN (Solicitudes de Patentes EP Nº

83.286 y Nº 110.385) . Los virus vacunas recombinantes preparados de esta manera pueden usarse, por un lado, como vacunas vivas para la profilaxis de infecciones, y por otro lado, para la preparación de proteínas heterólogas en células eucariotas.

El virus vacuna está entre los vectores vivos más exhaustivamente evaluados y tiene características particulares en apoyo de su uso como vacuna recombinantes: es altamente estable, barato de fabricar, fácil de administrar, y puede alojar grandes cantidades de ADN externo. Tiene la ventaja de inducir tanto respuestas de anticuerpos como respuestas citotóxicas, y permite la presentación de antígenos al sistema inmune de una manera más natural, y se usó con éxito como vacuna de vector que protege contra enfermedades infecciosas en una amplia variedad de modelos de animales. Además, los vectores vacuna son herramientas de investigación extremadamente valiosas para analizar la relación estructura-función de las proteínas recombinantes, determinar dianas de respuestas inmunes tumorales y mediadas por las células, e investigar el tipo de defensa inmune necesaria para proteger contra una enfermedad específica.

Sin embargo, el virus vacuna es infeccioso para seres humanos y su uso como vector de expresión en el laboratorio ha estado muy afectado por motivos de seguridad y regulaciones. Además, la réplica productiva del vector vacuna recombinantes dificulta las posibles futuras aplicaciones de virus vacuna recombinante, por ejemplo, para generar proteínas recombinantes o partículas víricas recombinantes para nuevas técnicas terapéuticas o profilácticas en humanos. La mayoría de los virus vacunas recombinantes descritos en la bibliografía se basan en la cepa Western Reserve (WR) del virus vacuna. Por otro lado, se conoce que esta cepa es altamente neurovirulenta y de este modo no es nada adecuada para su uso en humanos y animales (Morita y col., Vaccine 5, 65-70 [1987]) .

Las preocupaciones relativas a la seguridad de las cepas convencionales de VV han sido tratadas por el desarrollo de los vectores vacuna de cepas de virus altamente atenuados que se caracterizan por su capacidad replicativa restringida in vitro y su avirulencia in vivo. Las cepas de los virus especialmente cultivadas para evitar efectos secundarios no deseados se han conocido durante mucho tiempo. De este modo, ha sido posible, mediante pasos en serie a largo plazo de la cepa Ankara del virus vacuna (CVA) en fibroblastos de embriones de pollo, cultivar VMA (para revisión véase Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. y Stickl, H. (1975) Infection 3, 6-14; Patente Suiza Nº 568 392) . El virus VMA se depositó en cumplimiento con los requisitos del Tratado de Budapest en CNCM (Insititut Pasteur, Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) el 15 de diciembre de1987 bajo el número de depósito I-721.

El virus VMA se ha analizado para determinar las alteraciones en el genoma relativo a la cepa CVA de tipo salvaje. Se han identificado seis deleciones principales (deleción I, II, III, IV, V y VI) (Meyer, H., Sutter, G. y Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 1031-1038) . Este virus vacuna modificado de Ankara tiene solamente una baja virulencia, es decir, no le siguen efectos secundarios cuando se usa para vacunación. Por lo tanto, es particularmente adecuado para la vacunación inicial de sujetos inmunocomprometidos. Las excelentes propiedades de la cepa VMA se han demostrado en un número de ensayos clínicos (Mayr y col., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], stickl y col., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]) .

El virus vacuna modificado de Ankara (VMA) es una herramienta valiosa como vector vírico seguro para la expresión de genes recombinantes y puede usarse para diferentes fines tales como el estudio in vitro de funciones proteicas o la inducción in vivo de respuestas inmunes celulares específicas del antígeno o humorales. Una principal ventaja de VMA es que permite un alto nivel de expresión genética a pesar de carecer de réplica en células humanas y en la mayoría de las células de mamíferos. El VMA como vacuna tiene un excelente historial de seguridad, puede manipulares bajo condiciones de nivel 1 de bioseguridad y ha demostrado ser inmunogénico y protector cuando entrega antígenos heterólogos en animales (1-8) , y las primeras vacunas humanas candidatas han avanzado hasta ensayos clínicos.

Aunque es incapaz de multiplicarse en la mayoría de las líneas celulares de seres humanos, el VMA mantiene intacta la expresión de los genes víricos y heterólogos (Sutter y Moss, 1992) . La ausencia de patogenicidad para humanos, la inherente avirulencia incluso en huéspedes inmunocomprometidos, la expresión de alto nivel de antígenos extraños y el factor adyuvante para respuestas inmunes hacen de VMA recombinante (VMAr) un vector ideal tanto para la vacunación profiláctica como la terapéutica, como lo demuestra el amplio uso en estrategias de sensibilización y refuerzo (Meseda y col., 2002, Amara y col., 2002) y en ensayos clínicos en curso (McConkey y col., 2003; Cosma y col., 2003; Hanke y col., 2002) .

De hecho, las vacunas basadas en VMA recombinante (VMAr) provocan respuestas inmunes tanto humorales como adaptivas mediadas por células (Ramirez y col., 2000) y han demostrado ser protectoras en modelos de animales de varias enfermedades infecciosas (Hanke y col., 1999; Barouch y col., 2001; Weidinger y col., 2001; Schneider y col., 1998; Sutter y col., 1994b; Hirsch y col., 1996; Wyatt y col., 1996) e incluso en algunos modelos de tumor (Carroll y col., 1997; Rosales y col., 2000; Drexler y col., 1999) .

Los procedimientos convencionales para generar VVr se han descrito con detalles (Earl y col., 1998) y se basan en recombinación homóloga in vivo entre ADN de VV del aceptor y el plásmido de transferencia transfectada, en el que el gen externo está flanqueado por secuencias de VV. Las técnicas adicionales para la generación de VMA recombinantes son, por ejemplo, las desveladas en los documentos WO 04074493, WO 03023040 y WO 9702355.

WANG y col., Blood, Agosto 2004, Vol. 104, Nº 3 desvela técnicas inmunoterapéuticas para limitar la morbididad y mortalidad del citomegalovirus (CMV) después de trasplantes de célula madre hematopoyética. Una técnica comprende el intento de insertar antígenos CMV modificados con ubiquitina en la cepa virulenta Western Reserve del virus vacuna (VV) y la cepa altamente atenuada, virus vacuna modificado de Ankara (VMA) . Los antígenos CMV modificados con ubiquitina fueron antígenos inmunodominantes de fosforoproteínas 65 (pp65) , fosforoproteína 150 (pp150) y proteína 1 temprana inmediata (IE1) .

Sin embargo, WANG y col., mostraron que la ubiquitinización no tuvo ningún impacto o muy poco impacto sobre la inmunidad primaria para los antígenos CMV que VMAr transportaba.

Aunque el virus vacuna modificado de Ankara es considerado un vector vírico valioso y seguro para la expresión de genes recombinantes, está ampliamente aceptado que existen límites superiores para la administración de VMA a mamíferos, en particular seres humanos. Por ejemplo, la administración de VMA... [Seguir leyendo]

1. Un medicamento que incluye un equipo de partes que comprende los siguientes componentes:

a) un primer componente que comprende una o más proteínas extrañas o un ácido nucleico que codifica las mismas o partes funcionales de las mismas, cuyas partes funcionales contienen una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje; y b) un segundo componente que comprende un Virus Vacuna Modificado de Ankara (VMA) , que transporta una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende:

- ubiquitina o una parte funcional de la misma, cuya parte funcional contiene una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje; y

- una o más proteínas extrañas, es decir, una o más proteínas que no están presentes de modo natural como una parte del VMA o partes funcionales de las mismas, cuya parte funcional comprende una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje;

en el que la una o más proteínas extrañas son las mismas en a) y b) , y en el que los primeros y segundos componentes comprenden además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. El medicamento de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende además un adaptador entre la ubiquitina y la proteína extraña.

3. El medicamento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína extraña es una proteína heteróloga derivada del grupo consistente en polipéptidos terapéuticos y polipéptidos de agentes patógenos y partes funcionales de los mismos.

4. El medicamento de la reivindicación 3, en el que el polipéptido terapéutico se deriva de un grupo consistente en proteínas segregadas, por ejemplo, polipéptidos de anticuerpos, quimioquinas, citoquinas o interferones, o en el que el agente patógeno se deriva del grupo consistente en virus, preferentemente seleccionados del grupo consistente en virus de la gripe, sarampión y virus sincitiales respiratorios, virus de dengue, virus de inmunodeficiencia humana, virus de hepatitis humana, virus del herpes o virus de papiloma; bacterias, preferentemente Micobacteria causante de la tuberculosis; protozoos, preferentemente Plasmodium falciparum; y parásitos así como células tumorales o antígenos asociados a la célula tumoral y partes funcionales de los mismos.

5. El medicamento de la reivindicación 4, en el que el antígeno asociado a la célula tumoral se selecciona del grupo consistente en antígenos de diferenciación asociados con melanoma, por ejemplo, tirosinasa, proteínas 1 y 2 relacionadas con tirosinasas, de antígenos de cáncer de testículos, por ejemplo, MAGE-1, -2, -3, y BAGE, y de antígenos compartidos no mutados sobreexpresados en tumores, por ejemplo, Her-2/neu, MUC-1 y p53.

6. El medicamento de una o más de las reivindicaciones 1-5, en el que las regiones que codifican la proteína de fusión y/o la proteína extraña está cada una flanqueada por secuencias de ADN, que flanquean un lugar no esencial dentro del genoma del VMA, en el que el lugar no esencial es preferentemente el lugar de deleción III en el genoma del VMA.

7. El medicamento de una o más de las reivindicaciones 1-6, en el que la proporción de la cantidad del primer componente con el segundo componente es de 1:5 a 1:20, preferentemente 1:10, medida como unidades infecciosas (UI) de partículas de VMA recombinante.

8. El medicamento de una o más de las reivindicaciones 1-7 para su uso en la terapia anti-cáncer o en la prevención de enfermedades infecciosas.

9. El medicamento de una o más de las reivindicaciones precedentes, en el que un vector vírico transporta los ácidos nucleicos del componente a) .

10. El medicamento de la reivindicación 9, en el que el vector es VMA.

11. Un medicamento como el definido en una o más de las reivindicaciones 1-10 para sus uso en un procedimiento para mejorar las respuestas de célula T en un mamífero, preferentemente un ser humano, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) proporcionar un medicamento como el definido en una o más de las reivindicaciones 1-10; b) estimular a un mamífero con una cantidad del primer componente efectivo para proporcionar una respuesta inmune primaria; c) reforzar dicho mamífero con una cantidad del segundo componente efectivo para proporcionar una respuesta inmune secundaria.

12. El medicamento de la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de cáncer o para su uso en la prevención de enfermedades infecciosas.

13. El medicamento de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que la etapa de refuerzo se realiza en la semana 2-12, 5 preferentemente 4-8 después de la etapa de estimulación.

14. El medicamento de las reivindicaciones 11-13 para su uso en un procedimiento de vacunación.

15. Un VMA recombinante que transporta una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende:

- ubiquitina o una parte funcional de la misma, cuya parte funcional contiene una o más sustituciones,

inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la misma función que la proteína de tipo salvaje; y

- una o más proteínas extrañas, es decir, una o más proteínas que no están presentes de modo natural como una parte del VMA o partes funcionales de las mismas, cuya parte funcional comprende una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones cuando se compara con la proteína de tipo salvaje aunque tiene la

misma función que la proteína de tipo salvaje, para su uso en terapia anti-cáncer o en la prevención de enfermedades infecciosas como un agente de refuerzo en vacunaciones de sensibilización y refuerzo.

10e5 UI

La lisis específica in vivo (5h) se evaluó el día 5 después del refuerzo como se indica