Composiciones para inhibir expresión genética y usos de las mismas.

Un compuesto sintético basado en oligonucleótidos que comprende dos oligonucleótidos que son complementarios a una secuencia de ARN de cadena sencilla,

en donde los oligonucleótidos están enlazados en sus extremos 5', de tal manera que el compuesto basado en oligonucleótidos tiene dos extremos 3' accesibles y el compuesto basado en oligonucleótidos hibrida específicamente a e inhibe la expresión de la secuencia de ARN de cadena sencilla.

Composiciones para inhibir expresión genética y usos de las mismas Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se relaciona con compuestos, composiciones y métodos de uso para la inhibición de expresión y/o actividad genética o para diagnóstico, tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o condiciones que responden a la inhibición de la expresión y/o actividad genética.

Resumen de la técnica relacionada

Una metodología para inhibir la expresión genética es la tecnología antisentido o inhibición de ARN (ARNi). Estas metodologías hacen uso del enlazamiento específico para secuencias de ADN y/o ARN con base en oligonucleótidos a objetivos de ARNm, microARN, ARNpre o ARN mitocondrial seleccionados y la inhibición de la traducción que resulta de los mismos. Está inhibición basada en oligonucleótidos de traducción y finalmente de la expresión genética es el resultado de uno o más mecanismos celulares, los cuales pueden incluir pero no se limitan a (i) bloqueo directo (estérico) de la traducción, (¡i) inhibición mediada por la H-ARNsa, y (iii) inhibición mediada por ARNi (esto es, ARNI de interferencia corto (ARNsi), microARN (ARNmi), ARNi dirigido a ADN (ddARNi) y ARNi de cadena sencilla (ssARNi)).

La historia de la tecnología antisentido ha revelado que en tanto la determinación de los oligonucleótidos antlsentldo que se enlazan a ARNm es relativamente fácil, la optimización de los oligonucleótidos antisentido que tienen verdadero potencial para inhibir la expresión genética y por lo tanto ser buenos candidatos clínicos no lo es. De acuerdo con lo anterior, si una metodología basada en oligonucleótidos para subregular la expresión genética va a ser exitosa, hay necesidad para optimizar los oligonucleótidos antisentido que alcanzan más eficientemente este resultado. Tales oligonucleótidos antisentido optimizados podrían ser utilizados solos o en conjunción con otras composiciones profilácticas y/o terapéuticas.

Desde que Zemecnik y Stephenson publicaron la primera demostración de la utilización de oligonucleótidos antlsentldo como medio para inhibir la traducción de proteínas virales (Zemecnik y Stephenson (1978) Proc. Nati. Acad. Sel. 75:285- 288), ha habido un gran interés en la utilización de compuestos basados en oligonucleótidos para inhibir la expresión de genes. Estos esfuerzos iniciales utilizaron oligodesoxirribonucleótidos u oligorribonucleótidos no modificados, de cadena sencilla (Agrawal) et al. (1992) Ann. NY Acad. Sci. 66:2-1) los cuales son inherentemente inestables in vivo, para enlazar ARNm in vivo y crear una plantilla de ARN de cadena doble para degradación enzimática o por ARNse. Se han hecho esfuerzos subsecuentes para determinar la utilidad de los oligodesoxirribonucleótidos que incorporaba enlaces fosforotioato y/o metilfosfonato resistentes a la nucleasa (Agrawal et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:779-783; Metelev & Agrawal US 5,652,355; Metelev & Agrawal US 6,143,881; Matsukura et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. 84: 776).

Otra clase de moléculas basadas en ARN que inhiben la expresión genética son denominadas como ribozimas. Las ribozimas forman estructuras de tallo en bucle y se enlazan al ARN objetivo para mediar su escisión directamente (Cech, T. (199) Ann. Rev. Biochem. 59:543). Las ribozimas se enlazan selectivamente a ARN objetivo y catalizan una transesterificación o una reacción de hidrólisis para escindir enlaces fosfodiestéres específicos en ARN de cadena sencilla. Si se introducen en las células, las ribozimas tienen el potencial de enlazarse a un ARNm objetivo e inhibir la traducción de tal ARNm. Como sucede con las tecnologías antisentido de cadena sencilla, la estabilidad de actividad de las ribozimas han mejorado a través de la incorporación de ciertas modificaciones químicas en la estructura de la ribozima (Goodchild US 6,24,27; Goodchild US 6,573,72). En tanto las tecnologías de oligonucleótidos antisentido y ribozima continúan avanzando, se están haciendo descubrimientos con otras tecnologías basadas en oligonucleótidos.

Con base en los descubrimientos pioneros de Fire y Mello (Fire et al. (1998) Nature, 391:86-811), los esfuerzos han girado hacia las tecnologías de interferencia de ARN (ARNi) (por ejemplo, ARN de interferencia corta (ARNsi), microARN (ARNmi), ARNi dirigido a ADN (ddARNi), y ARNi de cadena sencilla (ssARNi)) en sistemas mamíferos. ¡ARN se refiere al proceso de inhibición postranscripción de la expresión genética utilizando oligonucleótidos cortos que están diseñados para hibridar a objetivos de ARN específicos (Fire et al. (1998) Nature 391:86-811; Zamore et al. (2) Cell, 11:25- 33). En el caso de ARNsi, las moléculas de ARN de cadena doble, cortas, utilizan maquinaria enzimática celular para escindir las moléculas de ARN objetivo homologas. (Rana (27) Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 8:23-36). Las tecnologías de ARNi de cadena doble se basan en la administración o expresión de ARN de cadena doble (ARNds), el cual una vez dentro de la célula, es enlazado por una enzima denominada cortadora y se escinde en 21-23 nucleótidos. El complejo resultante cortador ARNds es suministrado e interactuado con un complejo que contiene Argonaut de proteínas denominado como complejo silenciador inducido por ARN (RISC). Se cree que el RISC está presente en células para romper catalíticamente moléculas de ARNm específicas. Una vez enlazado por el RISC, el ARNds es desatado dando

como resultado un complejo ARNss-RISC, el cual es capaz de hibridar a ARNm objetivo. Una vez hibridado, el complejo RISC rompe el ARNm. En algunos casos, los procesos específicos de ARNds de corte han sido eludidos utilizando composiciones de ARNi de cadena sencilla (ssARNi) que interactúan directamente con RISC para alcanzar la inhibición de la expresión genética (Holen et al. (23) Nuc. Acids Res. 31:241-247). Aunque las tecnologías de ARNi son capaces de enlazar selectivamente a ARNm, tales moléculas también han sido reconocidas por inducir la estimulación inmune no específica a través de la interacción con TLR3 (Kleinman et al., (28) Nature 452:591-597; De Veer et. al. (25) Immun. Cell Bio. 83:224-228; Kariko et al. (24) J. Immunol. 172:6545-6549). Esta activación inmune no específica ha generado preguntas con referencia a la utilidad de las tecnologías de ARNi como agentes farmacéuticos.

Aunque cada una de estas tecnologías basadas en antisentido han sido utilizadas con algún éxito, como resultado de estar basadas en oligonucleótidos, cada una de estas tecnologías tiene el problema inherente de ser inestable in vivo y de tener el potencial de producir efectos fuera del objetivo, por ejemplo estimulación inmune no buscada (Agrawal & Kandimalla (24) Nature Blotech. 22:1533-1537). En el caso del ARNds, estos oligonucleótidos parecen tener el problema adicional de administración ineficiente in vivo a las células (Medarova et. al (27) Nature Med. 13:372-377). A pesar de muchos ensayos clínicos de candidatos fármacos oligonucleótidos antisentido, solo uno de tales compuestos ha sido aprobado como fármaco por la FDA. Este compuesto antisentido fue aprobado para el tratamiento de CMV, pero nunca ha sido comercializado como un producto. Adicionalmente, no se ha aprobado ningún candidato a fármaco de ribozima o ARNsi por parte de la FDA.

Las metodologías para utilizar cada una de estas tecnologías han estado enfocadas en dirigirse a la bioestabilidad, reconocimiento de objetivos (por ejemplo, permeabilidad celular, termoestabilidad), y actividad in vivo. Frecuentemente, estas han representado consideraciones competitivas. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido tradicionales utilizan enlaces internucleótidos de éster de fosfato, los cuales demuestran ser bastante inestables biológicamente para hacer efectivos. Así, ha habido esfuerzos para modificar los oligonucleótidos antisentido para hacerlos más estables biológicamente. Las metodologías iniciales se enfocaron en la modificación de los enlaces internucleótidos para hacerlos más resistentes a la degradación por parte de las nucleasas celulares. Estas metodologías llevaron al desarrollo de oligonucleótidos antlsentido que tienen una variedad de enlaces internucleótidos de origen no natural, tales como fosforotioato, metllfosfonato (Sarin et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:7448-7451), y enlaces basados en péptidos (Matsukura et. al (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. 84:776; Agrawal et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:779-783; Miller (1991) Blo-Technology 9:358). Sin embargo, estas modificaciones hicieron que las moléculas disminuyeran su especificidad al objetivo y produjeran actividades biológicas no deseadas.

Tecnologías posteriores para mejorar la estabilidad... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto sintético basado en oligonucleótidos que comprende dos oligonucleótidos que son complementarios a una secuencia de ARN de cadena sencilla, en donde los oligonucleótidos están enlazados en sus extremos 5, de tal manera que el compuesto basado en oligonucleótidos tiene dos extremos 3 accesibles y el compuesto basado en oligonucleótidos hibrida específicamente a e inhibe la expresión de la secuencia de ARN de cadena sencilla.

2. El compuesto basado en oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde los oligonucleótidos tienen independientemente 15 a 4 nucleótidos de longitud.

3. El compuesto basado en oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde los oligonucleótidos están enlazados uno a otro a través de un enlace nucleotídico o a través de un enlazante no nucleotídico.

4. El compuesto basado en oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde los oligonucleótidos comprenden uno o más ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos asegurados, nucleótidos de arabinoazúcar o una combinación de los mismos.

5. El compuesto basado en oligonucleótidos de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los oligonucleótidos está modificado.

6. El compuesto basado en oligonucleótidos de la reivindicación 5, en donde el oligonucleótido modificado tiene al menos un enlace de internucleótidos seleccionado del grupo consistente de alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, y un enlazante no nucleotídico.

7. El compuesto basado en oligonucleótidos de la reivindicación 5, en donde el oligonucleótido modificado comprende al menos un nucleótido sustituido en 2-O- seleccionado del grupo consistente de 2-O-metilo, 2-O-metoxi, 2-O-etoxi, 2- O-metoxietilo, 2-O-alquilo, 2-O-arilo o 2-O-alilo.

8. Una composición que comprende un compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

9. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en la inhibición de expresión genética.

1. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9, en donde los oligonucleótidos son complementarios a un ARN que codifica Bcl-2, EGFR, msm2, MyD88, PCSK9, survivina, VEGF o un TLR.

11. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el TLR es seleccionado de TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 y TLR9.

12. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 9, en donde cada uno de los oligonucleótidos es complementario a una región diferente de la secuencia de ARN de cadena sencilla.

13. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicación 1 a 7 para uso en un método para tratar terapéuticamente un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno mediados por una proteína, en donde los oligonucleótidos son complementarios del ARN de cadena sencilla que codifica la proteína.

14. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en un método para prevenir una enfermedad o trastorno mediados por una proteína de un mamífero en riesgo de desarrollar la enfermedad o trastorno, en donde los oligonucleótidos son complementarios al ARN de cadena sencilla que codifica la proteína.

15. El compuesto basado en oligonucleótidos de las reivindicaciones 13 o 14, en donde la enfermedad o trastornos son seleccionados de cáncer, un trastorno autoinmune, inflamación de las vías respiratorias, trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, trastornos de la piel, alergia, asma, infección bacteriana, viral o fúngica, o una enfermedad causada por un patógeno.

16. El compuesto basado en oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, el cual es administrado en conjunción con una o más vacunas, antígenos, anticuerpo, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, agonistas de TLR, antagonistas de TLR, moléculas de ARNsi, moléculas de ARNmi, oligonucleótidos antisentido, aptámeros, proteínas, péptidos, vectores de terapia genética, vacunas de ADN, adyuvantes, antagonistas de actividad proteínica, inhibidores de quinasa, agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos direccionados, moléculas coestimuladoras o combinaciones de los mismos.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende adicionalmente una o más vacunas, antígenos, anticuerpos, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, inhibidores de quinasa, alérgenos, antibióticos, agonistas, antagonistas, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, moléculas de iARN, moléculas de ARNsi, moléculas de ARNmi, aptámeros, proteínas, vectores de terapia genética, vacunas de ADN, adyuvantes, moléculas coestimuladoras o 5 combinaciones de los anteriores.