Composición inhibidora de la agregación plaquetaria.

Composición farmacéutica para su utilización como un medicamento que comprende por lo menos un polipéptido de los (a) a (b) siguientes como un componente activo:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; y

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de 70% o superior respecto a la secuencia de aminoácidos del (a) anterior y que presenta una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria.

Composición inhibidora de la agregación plaquetaria.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un polipéptido que presenta una actividad inhibidora de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de su adhesión, o a una composición farmacéutica por ejemplo, una composición inhibitoria de la agregación plaquetaria que incluye un producto de expresión (polipéptido recombinante), que se expresa mediante un polinucleótido que codifica el polipéptido como un componente activo.

La presente invención se refiere además a un polipéptido que presenta una capacidad de unión al colágeno, o a una composición farmacéutica que comprende al polipéptido como componente activo.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para el cribado de un compuesto (por ejemplo, un agonista), que facilita la actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria como un compuesto activo en la composición farmacéutica. Además, la presente invención se refiere a un polipéptido que posee la actividad inhibitoria de agregación plaquetaria y un polinucleótido que codifica al mismo.

Técnica anterior

La agregación plaquetaria se debe a la alteración de las células endoteliales vasculares, y a otros factores diversos. Cuando un vaso coronario, un vaso cerebral o un vaso periférico, se ocluyen por este trombo plaquetario, se producen, respectivamente, infarto miocárdico, infarto cerebral u obstrucción arterial crónica. Los ejemplos de enfermedades trombóticas después de dicha activación (estimulación de la agregación) de las plaquetas, incluyen esclerosis arterial, infarto cerebral isquémico, enfermedades cardíacas isquémicas que incluyan infarto miocárdico y angina, obstrucción crónica arterial y trombosis venosa.

Los medicamentos que inhiben la agregación plaquetaria se utilizan como preventivos para enfermedades isquémicas que presentan como complicaciones las varias patologías antes mencionadas, y como medicamentos preventivos para estados patológicos subsiguientes a hipertensión, hipertensión pulmonar, infarto cerebral, infarto pulmonar y hemorragia subaracnoidea. Además, los medicamentos mencionados se utilizan para prevenir la formación de trombos después de la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) y del emplazamiento de las endoprótesis vasculares, utilizándose asimismo como agentes preventivos de la restenosis después de que dichas prótesis se sitúen, envolviendo dichos medicamentos (que poseen la acción de inhibir la agregación plaquetaria) a, o integrándolos, en las endoprótesis vasculares mismas.

Mientras tanto, un mosquito penetra la piel con su afilada aguja oral, que alcanza los vasos sanguíneos periféricos cuando succiona la sangre, repitiendo frecuentemente un pinchazo (en un comportamiento "interior y exterior"), que se refiere a un sondeo para encontrar el vaso sanguíneo periférico. Se cree que el mosquito segrega simultáneamente saliva que contiene una sustancia para facilitar la vasodilatación que facilite la detección del vaso sanguíneo. Debido al sondeo anterior, el vaso sanguíneo periférico se daña a menudo hasta congestionarse. Generalmente cuando el vaso sanguíneo se daña, se expone el colágeno tisular bajo el endotelio vascular, y a partir de las células rotas, se libera el adenosin difosfato (ADP), activándose los factores de coagulación para formar trombina. La trombina activa intensamente las plaquetas para inducir la adhesión plaquetaria, la agregación plaquetaria y la liberación de gránulos, formando eventualmente un trombo firme mediante la coagulación sanguínea con la formación de fibrina (mecanismo de hemostasia). Se ha conocido que la saliva del mosquito contiene la sustancia que inhibe dicho mecanismo hemostático (ver la literatura no de patente, 1).

Una proteína de la glándula salivar en el mosquito que se estudió con mayor detalle, es la apirasa. Este enzima es una sustancia que inhibe la agregación plaquetaria que se identificó en la saliva de Aedes aegypti al principio. La apirasa inhibe la agregación plaquetaria dando lugar a la descomposición del ADP liberado a partir de las células endoteliales vasculares dañadas, los eritrocitos y las plaquetas adheridas a AMP (adenosin monofosfato) y para exhibir una acción antihemostática. Para dilucidar un comportamiento vampírico de varios insectos vampíricos, más allá del mosquito, parece esencial analizar la función de sus sustancias salivares.

Se cree que diversas sustancias salivares están implicadas en la inhibición de la agregación plaquetaria, y, por ejemplo, se ha informado de una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria, para la proteína derivada de Triatoma infestans (ver documentos 1 y 2 de patente).

Entre las proteínas derivadas de la glándula salival en Anopheles stephensi, se ha identificado la proteína que posee una actividad inhibitoria de la coagulación sanguínea, pero no se ha observado una proteína que muestre una actividad inhibidora de la agregación plaquetaria (ver Documento 3 de patente).

Además, se ha informado de 33 nuevas proteínas a partir de la clonación de la biblioteca cADN de la glándula salival de Anopheles stephensi y, tal como se describe en el informe, no se encontraron proteínas que mostraran la

actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria, permaneciendo sus funciones, en muchas de ellas, desconocidas (ver la literatura 2 no de patente).

Se informó previamente de una proteína (AAPP) que presentaba una secuencia GE rica en (Gly Glu) clonada a partir de las glándulas salivares en Anopheles stephensi (ver literatura no de patente 3). La proteína muestra un marco de lectura abierto (ORF) de 810 bases, y la proteína que se deduce de 28,5 kDa que está compuesta por 269 residuos aminoácidos. Se encontró entonces que la proteína era similar a un antígeno de 30 kDa (Número de Registro en GenBank, AY226454), antígeno que se da a conocer en la literatura 2 no de patente, pero no existe descripción de acciones y funciones (actividad) de la proteína en las literaturas 2 y 3 no de patentes.

La literatura no de patente 4 se refiere al mARN ansg-1 de Anopheles stephensi para la proteína de la glándula salival rica en GE, cds completa. La literatura 6 no de patente se refiere a la expresión transgénica específica de la glándula salival en el mosquito Anopheles stephensi. La literatura 5 no de patente se refiere al procedimiento para la preparación de un inhibidor modificado palidipínico de la agregación plaquetaria inducida por el colágeno.

[Documento 1 de Patente] Publicación JP 2004-121091-A

[Documento 2 de Patente] Publicación JP 2004-121086-A

[Documento 3 de Patente] Publicación JP 2003-116573-A

[Literatura 1 de no de patente] Riberio, J.M., J. Exp. BioL, 108, 1-7 (1984)

[Literatura 2 de no de patente] Valenzuela, J.G., et al., Exploring the salivary gland transcriptome and proteome of the Anopheles stephensi mosquito" Insect Biochemistry.

[Literatura 3 no de patente] Hiroyuki Watanabe et al., Medical Entomology and Zoology 55 Suppl., pp41, 19 (2004).

[Literatura 4 no de patente]: DATABASE EMBL [Online] 3 Julio 2003 (2003-07-03), Anopheles stephensi ansg-1 mRNA for GE rich salivary gland protein, complete cds." recuperado del EBI, n° de registro EBL: AB113667, n° registro AB113667 de base de datos.

[Literatura 5 no de patente] WO 96/08563 A (SCHERING AG [DE]; NOESKE JUNGBLUT CHRISTIANE [DE]; BECKER ANDREAS [DE] 21 Marzo 1996(1996-03-21).

[Literatura 6 no de patente] DATABASE GENPEPT [Online] YOSHIDA S. ET AL., n° registro en base de datos (Q7YT37)

Exposición de la invención

La presente invención proporciona una nueva composición farmacéutica, particularmente un inhibidor de la agregación plaquetaria y/o un inhibidor de la adhesión plaquetaria.

La presente invención proporciona además una nueva composición farmacéutica que incluye una proteína, que posee una capacidad de unión al colágeno, como un componente activo.

La presente invención proporciona también un procedimiento para cribar una sustancia tal como un agonista, el procedimiento de cribado que determina una actividad inhibitoria de agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de adhesión plaquetaria de la sustancia.

Como resultado de otro estudio exhaustivo separado del llevado a cabo sobre la proteína (AAPP) del que se ha informado previamente, se descubrió una nueva proteína que mostraba una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria en las glándulas salivares del Anopheles stephensi, aislada con éxito e identificando un ADN codificante de a proteína, encontrando... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica para su utilización como un medicamento que comprende por lo menos un polipéptido de los (a) a (b) siguientes como un componente activo:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n°: 3; y

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de 70% o superior respecto a la secuencia de aminoácidos del (a) anterior y que presenta una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria.

2. Composición farmacéutica para su utilización como un medicamento que comprende un polipéptido, que es expresado mediante por lo menos un polinucleótido de los (c) a (e) siguientes como un componente activo:

(c) un polinucleótido que comprende la secuencia de ADN de SEC ID n°: 4, o su complemento;

(d) un polinucleótido que híbrida con el polinucleótido del (c) anterior bajo unas condiciones rigurosas y puede expresar un polipéptido que presenta una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria; y

(e) un polinucleótido que comprende la secuencia de ADN que presenta una homología de 80% o superior respecto al polinucleótido del (c) anterior y que puede expresar un polipéptido que presenta una actividad inhibitoria agregatoria plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria es la actividad inhibitoria a la agregación plaquetaria inducida por el colágeno y/o la actividad inhibitoria sobre la adhesión plaquetaria al colágeno.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha composición farmacéutica presenta la capacidad de unión al colágeno.

5. Inhibidor de la agregación plaquetaria y/o inhibidor de la adhesión plaquetaria, que comprende el polipéptido descrito en la reivindicación 1 o el polipéptido, que es expresado mediante el polinucleótido descrito en la reivindicación 2, para su utilización como un medicamento.

6. Composición farmacéutica para su utilización en el tratamiento o la prevención de un estado patológico causado por la formación de un trombo o émbolo que comprende por lo menos un polipéptido de los (a) a (b) siguientes como un componente activo:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID n°: 3; y

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de 70% o superior respecto a la secuencia de aminoácidos del (a) anterior y que presenta una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria.

7. Composición farmacéutica para su utilización en el tratamiento o la prevención de un estado patológico causado por la formación de un trombo o émbolo que comprende un polipéptido, que es expresado mediante por lo menos un polinucleótido de los (c) a (e) siguientes como un componente activo:

(c) un polipéptido que comprende la secuencia de ADN de SEC ID n°: 4, o de su complemento;

(d) un polinucleótido que híbrida con el polinucleótido del (c) anterior bajo condiciones rigurosas y puede expresar un polipéptido que presenta una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria; y

(e) un polinucleótido que comprende la secuencia de ADN que presenta una homología de 80% o superior respecto al polinucleótido del (c) anterior, y puede expresar un polipéptido que presenta una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria. 8

8. Procedimiento para el cribado de un agonista para una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad Inhibitoria de la adhesión plaquetaria, en el que un nivel de la actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria del polipéptido descrito en la reivindicación 1 se mide en presencia o ausencia de una sustancia objeto y un valor de medición en presencia de la sustancia objeto se compara con el valor de medición en ausencia de la sustancia objeto para seleccionar la sustancia objeto que aumenta la acción inhibitoria como el agonista.

9. Procedimiento para el cribado de un agonista para una actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria, en el que un nivel de la actividad Inhibitoria del polipéptido, que es expresado por el polinucleótido descrito en la reivindicación 2, se mide en presencia o ausencia de una sustancia objeto y un valor de medición en presencia de la sustancia objeto se compara con un valor de medición en ausencia de la sustancia objeto para seleccionar la sustancia objeto que aumenta la actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria como el agonista.

10. Procedimiento para el cribado de una sustancia candidata que facilita una actividad Inhibitoria de la agregación plaquetaria y/o una actividad inhibitoria de la adhesión plaquetaria del polipéptido descrito en la reivindicación 1 o el polipéptido descrito en la reivindicación 2 que comprende las etapas (1) a (4) siguientes:

(1) una etapa de preparación de un medio de cultivo que comprende una célula transformada con un vector de expresión, que expresa el polipéptido descrito en la reivindicación 1 o una célula que comprende el polipéptido, que se expresa por el polinucleótido descrito en la reivindicación 2 y plasma rico en plaquetas;

(2) una etapa de adición de un agente de agregación plaquetaria en el medio de cultivo del (1) anterior, para inducir la agregación plaquetaria en presencia o ausencia de una sustancia objeto;

(3) una etapa de medición de un nivel de la agregación plaquetaria en presencia o ausencia de la sustancia objeto en el (2) anterior; y

(4) una etapa de selección de la sustancia objeto como sustancia candidata cuando un valor de medición en presencia de la sustancia objeto es superior a un valor de medición en ausencia de la sustancia objeto.

11. Kit para el cribado de un agonista para el polipéptido descrito en la reivindicación 1 o el polipéptido expresado por el polinucleótido descrito en la reivindicación 2, caracterizado por que contiene como componentes plasma rico en plaquetas, uno del polipéptido descrito en la reivindicación 1 y el polipéptido descrito en la reivindicación 2, y un agente agregante plaquetario.

12. Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID n°: 3 o 5, para la utilización en terapia.

13. Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID n°: 3 o 5 para la utilización en el tratamiento o la prevención de un estado patológico causado por la formación de un trombo o émbolo.

14. Utilización de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID n°: 3 o 5, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una estado patológico causado por la formación de un trombo o émbolo.

15. Polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID n°: 3.

16. Polinucleótido que consiste en la secuencia de ADN de SEC ID n°: 4 o su complemento.