Columnas de cromatografía con emisores de electronebulización integrados.

Un método para fabricar una columna de cromatografía, columna de cromatografía que comprende:

un tubo de sílice (10) que comprende

un extremo ahusado (14) que forma un orificio que tiene un diámetro inferior a 3 micrómetros;

una cavidad tubular interior que tiene un diámetro de 75 micrómetros o inferior, y

una frita porosa (16) que comprende silicato;

en el que la frita porosa (16) se coloca adyacente al extremo ahusado (14) de 1 a 5 mm desde el orificio y tiene una longitud de aproximadamente 1 a 3 mm;

método que comprende:

(a) obtener un tubo de sílice (10) que comprende dos extremos abiertos y una cavidad tubular interior con un diámetro de 75 micrómetros o inferior que se extiende entre los dos extremos abiertos;

(b) depositar una composición líquida de silicato en la cavidad tubular interior del tubo en un primer extremo abierto del tubo;

(c) formar un material cerámico poroso a partir de la composición en la cavidad tubular interior del tubo en una posición cercana al primer extremo abierto de modo que se forma un espacio entre el material cerámico y el extremo abierto que está básicamente libre del material cerámico; y

(d) formar un emisor ahusado que tiene un diámetro de orificio inferior a 3 micrómetros en el primer extremo abierto.

Columnas de cromatografía con emisores de electronebulización integrados Campo técnico La presente invención se refiere a cromatografía, y más particularmente a columnas de cromatografía con frita porosa y emisores de electronebulización individuales micrométricos y submicrométricos, así como métodos para prepararlas.

Antecedentes La cromatografía líquida (LC) es una técnica analítica bien establecida para separar componentes de una mezcla fluida para análisis y/o identificación posterior, en la que una columna se rellena con un material de fase estacionaria 15 que por lo general es un sólido o gel finamente dividido tal como partículas pequeñas con diámetros de unos pocos micrómetros. Se puede usar una diversidad de diferentes detectores para detectar los analitos separados en una columna de LC. Además, los componentes separados se pueden pasar desde la columna de cromatografía líquida a otros tipos de instrumentos analíticos para análisis posterior, por ejemplo, la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) separa compuestos cromatográficamente antes de que se introduzcan en una fuente de iones de un espectrómetro de masas.

La espectrometría de masas ("MS") es una técnica analítica usada para medir la relación de masa a carga de iones en fase gaseosa. Esto se consigue ionizando una muestra y separando iones diferentes masas y registrando su abundancia relativa mediante la medida de intensidades de flujo de iones. La ionización por electronebulización (ESI) es una técnica de ionización aplicada normalmente cuando se trata con biomoléculas tales como péptidos y proteínas. El proceso de electronebulización crea gotitas altamente cargadas que, bajo evaporación, crean iones representativos de las especies contenidas en una solución de muestra.

La proteómica basada en espectrometría de masas, en particular espectrometría de masas con ionización por electronebulización acoplada a cromatografía líquida (LC-ESI-MS) , se ha convertido recientemente en la técnica de elección para la identificación y caracterización rápida de proteínas en sistemas biológicos. Además, en la actualidad existen múltiples enfoques para realizar estos experimentos de una forma semicuantitativa para controlar cambios en la expresión de proteínas y sucesos específicos después de la traducción como una función de la alteración biológica. A pesar de estas ventajas analizadas anteriormente, la espectrometría de masas experimenta intervalo dinámico limitado (por ejemplo, la incapacidad para detectar péptidos que abarcan una relación de abundancia superior a 5000:1 en una sola exploración/espectro) y tasa de adquisición finita (por ejemplo, la incapacidad de adquirir datos de MS/MS a una tasa suficiente para proporcionar información de secuencias en todos los péptidos en una mezcla compleja durante una sola realización de LC-MS/MS, independientemente de su abundancia relativa) . Estas limitaciones, combinadas con las tendencias actuales hacia el análisis de mezclas cada vez más complejas (biomarcadores, rutas de señalización, etc) continúa impulsando los límites de las columnas de capilares de sílice fundida con un D.I. de 75 µm y 100 µm (es decir, diámetro interno) usado en todas partes con resinas para HPLC en fase inversa de 5 y 10 µm de diámetro usadas ampliamente.

La Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0014143 desvela aparatos y métodos para 45 detección de biomoléculas dentro de una muestra. El aparato presenta una columna de separación y un emisor de electronebulización integrados que no incluye una polimerización in situ formada por una frita o tapón de cerámica de una composición líquida de silicato.

La Patente EP Nº 0231684 desvela columnas de cromatografía con tapones de cerámica fundida que proporcionan 50 soportes para lechos cromatográficos en dispositivos de cromatografía líquida y limitadores en dispositivos de cromatografía de fluido supercrítico.

La Patente de Estados Unidos Nº 6.190.559 desvela métodos para rellenar columnas de cromatografía que incluyen extraer una suspensión de material de relleno en un disolvente volátil en un extremo de una columna de 55 cromatografía, retirar el disolvente a través del mismo extremo para dejar el material de relleno atrás, y sinterizar el material de relleno depositado.

Sumario 60 La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que se puede conseguir un rendimiento de LC-MS excepcional usando columnas de cromatografía tal como se definen las reivindicaciones adjuntas. Estas columnas se pueden usar a caudales muy bajos, por ejemplo, tan bajos como 3-5 nanolitros/minuto e incluso 1 nanolitro/minuto.

La divulgación también presenta métodos para preparar tales columnas.

Las realizaciones pueden incluir una o más de las siguientes características. El método puede incluir rellenar el tubo con una suspensión de perlas que tienen un diámetro de aproximadamente 1, 8 µm a 5 µm, por ejemplo, después de formar el material cerámico. La composición líquida de silicato puede incluir silicato de litio y silicato de tetrametilamonio. El material cerámico se puede formar calentando la composición. El material cerámico se puede formar calentando la composición a 300 ºC o superior. El emisor ahusado se puede formar usando un extractor de pipeta basado de láser. El emisor ahusado puede tener un orificio con diámetro de 1, 5 micrómetros o inferior. El emisor ahusado se puede configurar para su uso como un emisor de electronebulización.

Las realizaciones también pueden incluir una o más de las siguientes características. El silicato de la columna de cromatografía puede incluir silicato de litio. El orificio puede tener un diámetro de 1, 5 micrómetros o inferior. El orificio puede tener un diámetro de 0, 75 micrómetros o inferior. La columna puede ser capaz de resistir una presión de 34, 47 MPa (6000 psi) o superior. La columna puede ser capaz de resistir una presión de 54, 71 MPa (7500 psi) o superior, por ejemplo, 62, 05 MPa (9000 psi) o superior. El orificio se puede dimensionar y configurar para su uso como un emisor de electronebulización en espectrometría de masas. El orificio se puede dimensionar y configurar para que funcione a un caudal de, por ejemplo, aproximadamente 10 nl/min o inferior. El caudal puede ser de 5 nl/min o inferior, por ejemplo, 1 nl/min o inferior.

Como se usa en el presente documento, la expresión "micrómetro simple" se refiere a una dimensión superior a 1 micrómetro e inferior a 10 micrómetros. El término "submicrómetro" se refiere a una dimensión inferior a 1 micrómetro.

Los aspectos y realizaciones que se describen en el presente documento pueden incluir una o más de las siguientes ventajas. Esta divulgación presenta la fabricación de columnas de HPLC capilares a base de sílice fundida con puntas emisoras de electronebulización integradas, que se pueden usar en experimentos de espectrometría de masas y cromatografía líquida basadas en proteómica. La construcción de columnas de HPLC a base de sílice fundida con puntas emisoras de electronebulización integradas disminuye el volumen muerto entre el lecho de la columna de HPLC y la punta emisora y por lo tanto aumenta el rendimiento cromatográfico. La formación in situ de fritas de retención de lecho de columna en capilares de sílice fundida de cualquier tamaño, especialmente de D.I. pequeño, facilita la construcción de capilares de HPLC de diámetro interno más pequeño con puntas emisoras de electronebulización arbitrariamente pequeñas. Además, los métodos que se desvelan en el presente documento se pueden usar en conjunto con la denominada LC de presión ultra elevada, que ofrece mejoras adicionales en el rendimiento cromatográfico. Por ejemplo, las nuevas columnas con emisores de electronebulización integrados preparados con los métodos que se desvelan en el presente documento pueden resistir presiones ultra elevadas, por ejemplo, 34, 47 MPa (5000 psi) o superior, 51, 71 MPa (7500 psi) o superior, 62, 05 MPa (9000 psi) o superior, e incluso 68, 95 MPa (10.000 psi) o superior.

La presente divulgación también presenta columnas preparadas con los métodos que se desvelan, que tienen diámetros internos arbitrariamente pequeños y tienen fritas de retención porosas que son mecánicamente estables, pero que aún permiten un flujo volumétrico suficiente para facilitar el relleno de lechos de LC de partículas y tienen estabilidad mecánica suficiente para resistir LC de presión ultra elevada y facilitar la colocación de puntas emisoras integradas cerca de la frita y con diámetros de orificio arbitrariamente pequeños. En particular, se han fabricado dispositivos con columnas capilares de... [Seguir leyendo]

1. Un método para fabricar una columna de cromatografía, columna de cromatografía que comprende:

un tubo de sílice (10) que comprende un extremo ahusado (14) que forma un orificio que tiene un diámetro inferior a 3 micrómetros;

una cavidad tubular interior que tiene un diámetro de 75 micrómetros o inferior, y una frita porosa (16) que comprende silicato;

en el que la frita porosa (16) se coloca adyacente al extremo ahusado (14) de 1 a 5 mm desde el orificio y tiene 10 una longitud de aproximadamente 1 a 3 mm;

método que comprende:

(a) obtener un tubo de sílice (10) que comprende dos extremos abiertos y una cavidad tubular interior con un 15 diámetro de 75 micrómetros o inferior que se extiende entre los dos extremos abiertos;

(b) depositar una composición líquida de silicato en la cavidad tubular interior del tubo en un primer extremo abierto del tubo;

(c) formar un material cerámico poroso a partir de la composición en la cavidad tubular interior del tubo en una

posición cercana al primer extremo abierto de modo que se forma un espacio entre el material cerámico y el 20 extremo abierto que está básicamente libre del material cerámico; y (d) formar un emisor ahusado que tiene un diámetro de orificio inferior a 3 micrómetros en el primer extremo abierto.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el material cerámico se forma por calentamiento de la composición. 25

3. El método de la reivindicación 1, en el que el emisor ahusado se forma usando un extractor de pipeta basada en láser.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el emisor ahusado tiene un diámetro de orificio de 1, 5 micrómetros o 30 inferior.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el emisor ahusado se configura para su uso como un emisor de electronebulización.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la composición líquida de silicato comprende silicato de litio y silicato de tetrametilamonio.

7. El método de la reivindicación 2, en el que el material cerámico se forma por calentamiento de la composición a 300 ºC o superior. 40

8. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente rellenar el tubo con una suspensión de perlas que tienen un diámetro de aproximadamente 1, 8 µm a 5 µm después de la formación del material cerámico.

9. Una columna de cromatografía que comprende: 45

un tubo de sílice (10) que comprende un extremo ahusado (14) que forma un orificio que tiene un diámetro inferior a 3 micrómetros;

una cavidad tubular interior que tiene un diámetro de 75 micrómetros o inferior, y una frita porosa (16) que comprende silicato;

en la que la frita porosa se coloca adyacente al extremo ahusado de 1 a 5 mm desde el orificio y tiene una longitud de aproximadamente 1 a 3 mm.

10. La columna de cromatografía de la reivindicación 9, en la que el silicato comprende silicato de litio.

11. La columna de cromatografía de la reivindicación 9, en la que el orificio tiene un diámetro de 1, 5 micrómetros o inferior.

12. La columna de cromatografía de la reivindicación 9, en la que el orificio tiene un diámetro de 0, 75 micrómetros o inferior. 60

13. La columna de cromatografía de la reivindicación 10, en la que el silicato comprende adicionalmente silicato de tetrametilamonio.