Celulasa tolerante a los tensioactivos y procedimiento de modificación de la misma.

Una combinación de un polinucleótido y una célula huésped, en la que el polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39;

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en la que de 1 a 90 nucleótidos han sido eliminados, sustituidos, insertados o añadidos en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39 y que codifica una proteína en la que el extremo N-terminal es ácido glutámico o glutamina y que tiene una actividad endoglucanasa; y

(c) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39 y que codifica una proteína en la que el extremo N-terminal es ácido glutámico o glutamina y que tiene una actividad endoglucanasa, y

en la que la célula huésped es un huésped en el que se lleva a cabo la formación de piroglutamato del aminoácido N-terminal.

Celulasa tolerante a los tensloactlvos y procedimiento de modificación de la misma Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para modificar el extremo N-terminal de una proteína que tiene actividad endoglucanasa (en especial, una celulasa perteneciente a la familia 45 y que tiene una actividad endoglucanasa) a ácido piroglutámico, para convertir la proteína en celulasa que tiene actividad endoglucanasa, cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña y está relacionada con la celulasa.

Antecedentes de la técnica

Se dice que la biomasa de celulosa es el recurso más abundante entre los recursos naturales y por lo tanto en diversos campos se desea una aplicación eficiente de sistemas de celulasas que descompongan la biomasa de celulosa. En este proceso de desarrollo, se purificaron y caracterizaron diversas celulasas y además, se han clonado diversos genes de celulasa y se han clasificado en familias analizando la homología de secuencias (véase referencia no de patente 1).

En otro aspecto, las celulasas se utilizan, basándose en sus propiedades, en diversos campos industriales, en particular en el campo de procesamiento de tejidos. Por ejemplo, se lleva a cabo un tratamiento con celulasa para mejorar el tacto y/o el aspecto de tejidos que contienen celulosa, o para un "biolavado", lo cual confiere un aspecto de "lavado a la piedra" a un tejido que contiene celulosa coloreado, proporcionando de este modo al tejido variaciones de color localizadas. Además, en el procedimiento para fabricar liocell, la celulasa se usa para retirar la pelusa generada en el procedimiento de la superficie del tejido. Al respecto, el liocell es un tejido de celulosa regenerado derivado de la pulpa de madera, que recientemente ha llamado la atención por sus propiedades (tales como la alta resistencia o la absorción de agua) y como un procedimiento de producción que provoca menos polución ambiental.

Hasta ahora, se ha considerado que la celulasa descompone la celulosa por el efecto colaborativo de varias enzimas, es decir, el efecto slnérgico. El grupo de celulasas que consiste en varias enzimas contiene enzimas que tienen propiedades Inadecuadas para el campo del procesamiento de tejidos (tales como una enzima que disminuye la resistencia de la fibra). Por consiguiente, se ha llevado a cabo un Intento para separar componentes enzimáticos adecuados para el procesamiento de tejidos del grupo de las celulasas y para producir los componentes enzimáticos, utilizando técnicas de separación de proteínas y/o técnicas de ingeniería genética. En particular, se han sometido a un estudio serio las celulasas derivadas de microorganismos que pertenecen a los hongos filamentosos tales como el género Trichoderma o el género Humicola. Por ejemplo, como componentes de celulasa, se aislaron CBH I, EG V (véase referencia de patente 1), NCE2, NCE4 y NCE5 en el género Humicola y CBH I, CBH II, EG II y EG III en el género Trichoderma y de este modo, se pueden producir preparaciones de celulasa que contienen como los componentes principales uno o más componentes de celulasa específicos apropiados para cada propósito por la preparación de enzimas sobreexpresadas o enzimas monocomponentes usando técnicas de ingeniería genética. Además, se ha aclarado que las celulasas que pertenecen a la familia 45, tales como NCE4 (véase referencia de patente 2), NCE5 (véase referencia de patente 3), RCE1 (véase referencia de patente 4) o STCE1 (véase Solicitud Internacional N° PCT/JP2004/15733), son muy útiles en los campos anteriores.

En otro aspecto más, cuando se usan las celulasas como un detergente para la ropa, no solamente se desea una mejora cuantitativa de los componentes de celulasa usados sino también una cualitativa. Más particularmente, un detergente para la ropa contiene diversos tensloactlvos y una solución obtenida por la solubilización del detergente para la ropa en agua es alcalina (pH 10 a pH 11). Por consiguiente, es necesario que las celulasas contenidas en un detergente para la ropa sean resistentes a diversos tensloactlvos, en condiciones alcalinas. Como un Informe en el que una reducción de la actividad en presencia de un tensioactivo se suprime, Otzen, D. E. y col. Informaron que cuando se introdujo una mutación en la secuencia Interna de aminoácidos de Cel45 derivada de Humicola insolens, la actividad de la misma a pH 7 en presencia de benceno sulfonato de alquilo lineal (LAS) era aproximadamente 3,3 veces superior a la del tipo natural (véase referencia no relacionada con patentes 2). Sin embargo, se encontró que la supresión de la reducción de la actividad en presencia del tensioactivo, proporcionada por la mutación, está limitada a Cel45 o a sus proteínas homologas y que no es aplicable a las endoglucanasas pertenecientes a la familia 45 que tienen baja homología con Cel45.

(referencia de patente 1) Publicación Internacional W091/17243

(referencia de patente 2) Publicación Internacional WO98/0366

(referencia de patente 3) Publicación Internacional W001/90375

(referencia de patente 4) Publicación Internacional WOOO/24879 (referencia no de patente 1) Henrlssat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695-696 (1996)

(referencia no de patente 2) Daniel E. Otzen, Lars Christiansen, Martin Schulein. A comparatlve study of the

unfolding of the endoglucanase Cel45 from Humicola ¡nsolens ¡n denaturant and surfactant. Protein Sci. 8: 1878- 1887(1999)

El documento WO 94/07998 se refiere a una variante de celulasa derivada de una celulasa parental, por ejemplo perteneciente a la familia 45 tal como una endoglucanasa de 43 kD de Humicola insolens. Varias propiedades de la variante de celulasa, tales como por ejemplo actividad alcalina, compatibilidad con ingredientes de composición detergente, retirada de suelo particulado, aclarado de color, eliminación de pelusa, depilación, reducción de aspereza y sensibilidad a tensioactivos aniónicos y sistemas blanqueadores de peroxidasa se mejoran eliminando o sustituyendo uno o más aminoácidos del dominio catalíticamente activo (CAD), el dominio de unión a celulasa (CBD), o la región de unión entre ambos dominios y/o por adición de uno o más aminoácidos a la región de unión y/o por adición de otro CBD en el extremo opuesto del CAD.

Divulgación de la invención

Problemas a resolverse por la invención

Un objeto de la presente invención es para proporcionar un procedimiento para convertir una proteína que tiene una actividad endoglucanasa (en particular, una proteína perteneciente a la familia 45 y que tiene una actividad endoglucanasa) en una proteína que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; un vector que se utiliza en el procedimiento; una proteína que tiene una actividad endoglucanasa cuya reducción en presencia de un tensioactivo es pequeña; y un polinucleótido que codifique la misma. Otro objeto de la presente invención es proporcionar, utilizando lo anterior, un microorganismo que produce de manera eficiente una proteína útil como una enzima para el lavado de ropa.

Medios para solucionar el problema

Los presentes inventores realizaron estudios intensivos y como resultado, encontraron que las proteínas en las que se añadió ácido piroglutámico (en adelante denominado algunas veces pQ en el presente documento) o un péptido que contenía pQ al extremo N-terminal de cada proteína perteneciente a la familia 45 y que tenían una endoglucanasa, es decir, celulasas con adición en el extremo N-terminal, tenían una actividad endoglucanasa que no presentaba ninguna reducción significativa en la actividad en presencia de un tensioactivo, en comparación con las celulasas de tipo natural.

La característica de que se mantenga una actividad endoglucanasa alta en presencia de un agente tensioactivo aniónico es particularmente útil en el caso de enzimas para el lavado de ropa, pero no se conoce una celulasa de tal tipo. Además, no se ha informado que las funciones inherentes a una enzima puedan mantenerse en presencia de un tensioactivo por la adición a la misma de ácido piroglutámico o de un péptido que lo contenga.

En otro aspecto de la presente invención, con respecto a todas las celulasas en las que el aminoácido N-terminal no está protegido y se desea el mantenimiento de la actividad en presencia de un tensioactivo, es posible, añadiendo ácido piroglutámico o un péptido que lo contiene a las celulasas, para suprimir la reducción de la actividad en presencia de un tensioactivo. La celulasa a la que se añade ácido piroglutámico o un péptido que lo contiene no está particularmente limitada, pero son preferibles las... [Seguir leyendo]

1. Una combinación de un polinucleótido y una célula huésped, en la que el polinucleótido está seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39;

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos en la que de 1 a 90 nucleótidos han sido eliminados, sustituidos, insertados o añadidos en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39 y que codifica una proteína en la que el extremo N-termlnal es ácido glutámlco o glutamina y que tiene una actividad endoglucanasa; y

(c) un polinucleótido que híbrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 37 o 39 y que codifica una proteína en la que el extremo N-terminal es ácido glutámico o glutamina y que tiene una actividad endoglucanasa, y

en la que la célula huésped es un huésped en el que se lleva a cabo la formación de plroglutamato del aminoácido N-terminal.

2. Una combinación de la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 1 y un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una célula huésped transformada con el vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1,

en la que la célula huésped es un huésped en el que se lleva a cabo la formación de piroglutamato del aminoácido N-terminal.

4. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la célula huésped es una levadura u hongo filamentoso.

5. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el hongo filamentoso es un microorganismo que pertenece al género Humicola o Trichoderma.

6. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el hongo filamentoso es Humicola insolens o Trichoderma viride.

7. Un procedimiento de producción de una proteína seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40, en la que el extremo N-terminal es ácido piroglutámico;

(b) una proteína modificada que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el extremo N-terminal es ácido piroglutámico y en la que han sido eliminados, sustituidos, insertados o añadidos de 1 a 30 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40 y que tiene una actividad endoglucanasa; y

(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 % de identidad con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4, 38 o 40, en la que el extremo N- terminal es ácido piroglutámico y que tiene una actividad endoglucanasa, que comprende:

cultivar la célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 y recuperar la proteína a partir de la célula huésped o del cultivo obtenido por medio del cultivo.