Cártamo con ácido gamma linolénico elevado.

Una planta de cártamo transgénica que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ

6-5 desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde dicha planta de cártamo produce semillas y en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel del 45%-50% o mayor en peso.

Cártamo con ácido gamma linolénico elevado Antecedentes de la invención El ácido gamma-linolénico (GLA) es un ácido graso esencial en la familia omega-6 que se encuentra principalmente en aceites vegetales. El GLA se sintetiza a partir de ácido linoleico (LA) a través de la acción de la enzima delta-seis desaturasa (A6-desaturasa) . Los efectos beneficiosos del GLA derivan del hecho de que el GLA sirve como el precursor a un número de otros ácidos grasos esenciales tales como ácido araquidónico, que es un precursor de prostaglandinas y otras moléculas fisiológicamente importantes.

Los ácidos grasos insaturados tal como los ácidos linoleico (C18 Δ 9, 12) y α-linolénico (C18 Δ 9, 12, 15) son constituyentes alimenticios esenciales que no pueden ser sintetizados por vertebrados porque mientras que las células de vertebrados pueden introduce dobles enlaces en la posición Δ9 de ácidos grasos, no pueden introducir dobles enlaces adicionales entre el doble enlace Δ9 y el extremo metilo de la cadena de ácido graso. Puesto que se requieren para sintetizar otros productos, los ácidos linoleico y α-linolénico son ácidos grasos esenciales, que habitualmente se obtienen de fuentes vegetales. Los mamíferos pueden convertir LA en GLA (C18, Δ 6, 9, 12) que a su vez se puede convertir a ácido araquidónico (20:4) , un ácido graso críticamente importante ya que es un precursor esencial de la mayoría de las prostaglandinas.

El suministro en la dieta de LA, en virtud de su conversión enzimática a GLA y después a ácido araquidónico, podría satisfacer la necesidad nutricional para GLA y ácido araquidónico. Sin embargo, el consumo de grasas que están menos altamente insaturadas, tal como LA, se ha correlacionado con riesgos de salud tal como hipercolesterolemia, ateroesclerosis y otros trastornos clínicos que aumentan la susceptibilidad a enfermedad coronaria. En contraste, el consumo de grasas que son más altamente insaturadas se ha asociado con concentración de colesterol en sangre disminuida y riesgo reducido de ateroesclerosis. Se ha mostrado que el consumo del ácido graso insaturado GLA es particularmente beneficioso. Por tanto, el consumo del GLA más insaturado se preferiría sobre el consumo de LA. Por tanto, sería deseable generar fuentes adicionales ricas en GLA para consumo humano.

GLA actúa como un precursor para la formación de eicosanoides incluyendo prostaglandinas. Las prostaglandinas son compuestos de tipo hormonal vitales que refuerzan las membranas celulares y sirven como moléculas de señalización celular. Se han observado efectos beneficiosos de GLA en seres humanos y animales. GLA puede ayudar a regular la presión sanguínea, reducir la inflamación y mejorar la función inmunitaria. El suplemento de GLA puede beneficiar una amplia gama de enfermedades y afecciones incluyendo lupus, cáncer, alergias, artritis y colitis ulcerosa. GLA puede mejorar la eficacia de fármacos usados para tratar cáncer. GLA puede ayudar a reducir los síntomas del síndrome premenstrual y menopausia; a mejorar la salud de la piel y a tratar eczema, acné, rosácea, psoriasis y caspa; a mejorar trastornos psiquiátricos y neurológicos incluyendo enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis múltiple, trastorno de hiperactividad con falta de atención, depresión y fenómeno de Raynaud; a bloquear neuropatía diabética; a tratar cirrosis del hígado; a mejorar afecciones de ojos secos tal como el síndrome de Sjogren; y a tratar enfermedades cardiovasculares, osteoporosis, hiperlipidemia y otros síntomas asociados con el envejecimiento. Además, GLA se ha implicado como un estimulador para que el cuerpo queme grasa parda. La grasa parda es la grasa corporal interna que rodea los órganos vitales y actúa fábrica que quema grasa, usando calorías para calor más que almacenarlas como grasa blanca. El quemar la grasa parda es importante para el mantenimiento del peso corporal ideal. El consumo aumentado de GLA puede, por tanto, ayudar a estimular el proceso del metabolismo de la grasa parda.

Los suplementos de GLA existentes típicamente derivan de fuentes vegetales que tienen naturalmente más GLA tal como aceite de onagra, aceite de grosella negra y aceite de borraja. Sin embargo, GLA representa una fracción relativamente pequeña de los ácidos grasos totales en estas fuentes naturales. Solo aproximadamente el 7-10% (onagra) , el 14-19% (aceite de grosella negra) y el 20-26% (aceite de borraja) de los ácidos grasos de estas fuentes están disponibles como GLA. A pesar de los amplios beneficios de salud del GLA, su uso está actualmente limitado por el alto coste y la baja concentración de los suplementos de GLA existentes. Un adulto medio necesitaría consumir 10 o más cápsulas de suplementos de GLA existentes para recibir sus beneficios de salud óptimos. Sería útil tener una fuente menos cara, fácilmente disponible de aceite que tuviera más GLA que los aceites de especialidad naturales actualmente usados para suplementos de GLA. Tal fuente permitiría a los consumidores recibir los beneficios de salud óptimos de GLA, mientras se gasta menos dinero en suplementos y se ingiere significativamente menos aceite total y menos calorías. Tal fuente se propuso en el documento WO 98/46763 usando plantas transgénicas que expresan Δ6 desaturasa.

El cártamo es un cultivo agrícola comercialmente importante. El cártamo se cultivó por primera vez en Oriente Próximo hace miles de años como una fuente de colorante y otros productos que podrían derivar de la planta. El cártamo en este siglo se ha utilizado como fuente de aceites comestibles. El cártamo se introdujo por primera vez en los Estados Unidos en la década de 1930 como fuente de aceites comestibles. Desde entonces, se han desarrollado variedades con contenido mejorado en aceite. El aceite de cártamo comprende principalmente los ácidos grasos palmítico, esteárico, oleico y LA. Los ácidos palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0) son ácidos graos saturados; oleico

(C18:1) y linoleico (C18:2) son ácidos grasos insaturados. Sin embargo, las plantas de cártamo naturalmente producen solo cantidades despreciables de GLA.

Como tal, las plantas de cártamo transgénicas con semillas que contengan niveles más altos de GLA que las naturales tendrían gran utilidad.

Breve compendio de las formas de realización preferidas de la invención La presente invención se dirige a plantas de cártamo que producen GLA. En un aspecto, se describen plantas de cártamo que producen semillas que incluyen al menos el 45-50% en peso de GLA, las semillas de tales plantas y el aceite de tales plantas. En formas de realización preferidas, el aceite tendrá aproximadamente el 45-50, 50-55 o el 55-60% o mayor en peso de GLA.

En un aspecto, se describen plantas de cártamo que contienen construcciones genéticas que incluyen secuencias de ácidos nucleicos que dirigen la expresión de una o más enzimas desaturasas. En un aspecto, la A6-desaturasa se usa sola para generar GLA en plantas que producen principalmente LA. Las construcciones incluyen secuencias codificantes para estas enzimas y generalmente incluyen secuencias promotora y de terminación. En una forma de realización ventajosa, el promotor es un promotor específico de semilla.

En una forma de realización, se describe una planta de cártamo transgénica que contiene un promotor recombinante funcional en una planta de cártamo, operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa, en la que la planta de cártamo produce semillas que contienen al menos el 45-50% en peso de GLA. La secuencia que codifica Δ6-desaturasa puede derivar de la planta Saprolegnia diclina. El promotor usado puede ser un promotor específico de semilla tal como un promotor de oleosina o un promotor de linina. Esta forma de realización también proporciona una semilla derivada de estas plantas transgénicas en la que los niveles de GLA en la semilla son al menos el 45-50% en peso del contenido total de ácido graso de la semilla. Esta forma de realización también proporciona aceite producido de las semillas de estas plantas transgénicas. Tal aceite puede contener el 45-50% o más en peso de GLA.

En aún otra forma de realización, se proporciona un método para producir GLA en una semilla de cártamo. El método incluye los pasos de cultivar una planta de cártamo que contiene un promotor recombinante funcional en una planta de cártamo, operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa, y cultivar la planta de cártamo en condiciones en las que se expresa la secuencia de Δ6-desaturasa. La secuencia que codifica Δ6-desaturasa puede derivar de la planta Saprolegnia... [Seguir leyendo]

1. Una planta de cártamo transgénica que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde dicha planta de cártamo produce semillas y en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel de.

45. 50% o mayor en peso.

2. La planta de cártamo transgénica de la reivindicación 1, en donde dicho promotor es un promotor específico 10 de semilla.

3. La planta de cártamo transgénica de la reivindicación 2, en donde el promotor específico de semilla es un promotor de oleosina o un promotor de linina.

4. Semilla derivada de la planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel de.

45. 50% o mayor en peso.

5. Un método para producir ácido gamma-linolénico (GLA) en una semilla de cártamo, dicho método comprende cultivar una planta de cártamo que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde dicha planta de cártamo se cultiva en condiciones en las cuales se expresa dicha Δ6-desaturasa, y en donde dicha planta de cártamo produce semillas y en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel de.

45. 50% o mayor en peso.

6. El método según la reivindicación 5, en donde dicho promotor es un promotor específico de semilla. 30

7. El método según la reivindicación 6, en donde el promotor específico de semilla es un promotor de oleosina o uno de linina.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 7 en donde dicho método comprende además aislar 35 semillas de dicha planta de cártamo.

9. El método según la reivindicación 8, en donde dicho método comprende además extraer aceite de dichas semillas de la planta de cártamo.

Ruta para la biosíntesis de GLA

Figura 1

Alineamiento de aminoácidos de delta-6 desaturasas vegetales Similitud: 99, 1%; Identidad: 62, 7%

AAC49700 -Borago officinalis (448) AAP23034 -Primula farinosa (453) AAP23036 -Primula vialli (453)

Figura 2

Alineamiento de aminoácidos de delta-6 desaturasas de hongos

Figura 3

Similitud : 53, 7%; Identidad: 7, 1%

AAF08685 Mortierella alpina D6 (457) BAB6905 Mucor circinelloides D6 (467) BAC57562 Mucor circinelloides D6 (532) Thraustochytrium aureum D6 (456) (SEQ ID NO: 33 del documento WO02081668 Saprolegnia diclina D6 (453) (SEQ ID NO: 14 del documento US 6.635.451)

Regiones conservadas en las delta-6 desaturasas Figura 4

Alineamiento de aminoácidos de delta-12 desaturasas vegetales Similitud: 95, 4%; Identidad: 57, 7%

AAT02411 -Brassica napus (384) AAC31698 -Borago officinalis (383) AAL68983 -Helianthus annuus (382) BAD12887 -Oriza sativa (388)

Figura 5

Alineamiento de aminoácidos de delta-12 desaturasas de hongos Similitud: 83, 2%; Identidad: 23, 9%

CAE47978 -Aspergillus furnigatus (424)

Figura 6 EAK94955 -Candida albicans (436) EAL03493 -Candida albicans (433) AAF08684 -Mortierella alpina (399)

Regiones conservadas en las delta-12 desaturasas Figura 7

Plásmido pSBS4766 para la expresión de delta-6 y delta-12 desaturasas de M. alpina

Figura 8

Plásmido pSBS4119 para la expresión de delta-6 desaturasa de S. diclina Figura 9

Plásmido pSBS4763 para la expresión de delta-6 desaturasa de M. alpina Figura 10