Bacteriocinas modificadas y métodos para su uso.

Una proteína bacteriocina de fibra caudal de elevado peso molecular (epm) que comprende una región de anclaje a placa base (BPAR) y un dominio de unión a receptor heterólogo (RBD),

en la que RBD es de una fibra caudal de un bacteriófago o protofago o una fibra caudal de otra bacteriocina que muestre características de unión diferentes de aquellas de la bacteriocina del BPAR y en la que BPAR comprende los aminoácidos 1-164 o 1-240 de una piocina de tipo R.

Bacteriocinas modificadas y métodos para su uso Campo de la divulgación

Esta divulgación se refiere a formas modificadas de bacteriocinas de origen natural de elevado peso molecular (epm), tales como las piocinas de tipo R de Pseudomonas aeruginosa. Las bacteriocinas se modifican en los extremos de sus fibras caudales en una región responsable de la especificidad y afinidad de unión a sus ligandos o receptores afines, tales como aquellos de las superficies de las bacterias. También se describen métodos para el uso de las bacteriocinas modificadas, tal y como para que se unan a receptores, incluyendo factores de virulencia o aptitud, sobre las superficies de bacterias.

Antecedentes de la divulgación

Actualmente la atención global se centra más en amenazas de patógenos virales que en enfermedades bacterianas. Sin embargo, las bacterias resistentes a antibióticos omnipresentes continúan causando estragos en el cuidado de pacientes y en el sostenimiento del gasto en hospitales y otras instalaciones de cuidados médicos. Al mismo tiempo, hay una disminución en el desarrollo de antibióticos en favor de fármacos para enfermedades crónicas y mejoras en el estilo de vida. En los últimos veinte años solo se han introducido en el mercado de los Estados Unidos dos nuevas clases de antibióticos (oxazolidinonas y lipopéptidos) (Wenzel, 2004).

Solo en los Estados Unidos, hay más de 2 millones de casos de infecciones bacterianas hospitalarias cada año. De estas, mueren aproximadamente 90.000 personas. La estadística más alarmante es que más del 70% de estos agentes bacterianos son resistentes a al menos un fármaco antibacteriano (Bad Bugs, No Drugs, 2004). Esta cifra continúa aumentando a una velocidad alarmante. El coste anual para la economía de los Estados Unidos de estas infecciones nosocomiales resistentes a antibióticos supera los 5 mil millones de dólares. La realidad de esta situación global amenazante forzará a una nueva estrategia para el desarrollo y uso de agentes antibacterianos (Talbot et al., 2006). En los casos donde se ha producido un uso extensivo (y un abuso) de los antibióticos en medicina humana y animal, también se ha producido la aparición de patógenos bacterianos resistentes a los antibióticos hasta el punto de que muchos antibióticos que antes fueron "fármacos milagrosos" actualmente son clínicamente ineficaces (Microbial Threatsto Health, 2003).

A modo de ejemplo, Pseudomonas aeruginosa es un patógeno ubicuo para plantas y animales que está mostrando una rápidamente creciente incidencia de resistencia a múltiples fármacos antibióticos (Microbial Threats to Health, 2003; Bad Bugs, No Drugs, 2004). P. aeruginosa es un bacilo bastón aerobio, móvil, gram-negativo. P. aeruginosa normalmente habita el suelo, el agua y la vegetación. Aunque rara vez causa enfermedad en personas sanas, es un patógeno oportunista que provoca aproximadamente el 10% de todas las infecciones nosocomiales (National Nosocomial Infection Survey report- Resumen de datos entre octubre de 1986-abrll de 1996). P. aeruginosa es el patógeno más común que afecta a pacientes con fibrosls quístlca (FQ) con un 61% de cultivo de especímenes positivos (Govan, J. R. W. y V. Deretic, 1996, MIcroblol. Revlews, 60(3):530-574) así como uno de los dos patógenos más comunes observados en las unidades de cuidados Intensivos (Jarvis, W. R. et al., 1992, J. Antimicrob. Chemother., 29(a supp.):19-24).

La mortalidad a causa de algunas infecciones por P. aeruginosa puede llegar a alcanzar el 50%. Actualmente, la infección por P. aeruginosa puede aún controlarse de manera eficaz con antibióticos, particularmente usando una combinación de fármacos. Sin embargo, ha mostrado resistencia a varios de los antibióticos comunes y es particularmente problemática en las unidades de cuidados Intensivos (Archibald, L. et al., 1997, Clin. Infectious Dis., 24(2):211-215; Fish, D. N., et al., 1995, Pharmacotherapy, 15(3):279-291). Además, P. aeruginosa ya ha demostrado mecanismos para adquirir plásmidos que contienen genes de resistencia múltiple a antibióticos (Jakoby, G. A. (1986), The bacteria, Vol. X, The biology of Pseudomonas, pp. 265-294, J. R. Sokach (ed.) Academic Press, London) y actualmente no hay vacunas aprobadas para la Infección por Pseudomonas.

Al igual que otras muchas especies bacterianas, la variabilidad de cepas de P. aeruginosa es bastante significativa. Se ha demostrado que la variabilidad sucede mediante una serie de mecanismos diferentes, estos incluyen, pero sin limitación, la integración de profagos en un genoma bacteriano (Zierdt, C. H. y P. J. Schmidt, 1964, J. Bacteriol. 87:1003-1010), la adición del gen de citotoxina de bacteriófagos (Hayashi, T., et al., 1994, FEMS MIcroblol. Lett. 122:239-244) y a través de transposones (Sinclair, M. I. and B. W. Holloway, 1982, J. Bacteriol. 151:569-579). Mediante este tipo de diversidad, se han incorporado nuevos mecanismos patogénicos en P. aeruginosa. Estas y otras transiciones, tales como la conversión al fenotipo mucoide, observado comúnmente en FQ, ilustran claramente la necesidad de una vigilancia continua.

Estas preocupaciones apuntan a la necesidad de herramientas diagnósticas y agentes terapéuticos dirigidos a una identificación adecuada de cepas resistentes a fármacos y a la erradicación de la virulencia.

Muchas bacterias producen bacteriocinas, que son sustancias bactericidas, durante el crecimiento. Las bacteriocinas están compuestas de polipéptidos y varían en cuanto a su peso molecular. Aunque se han usado bacteriocinas debido a sus propiedades antibacterianas, algunas tienen un espectro bactericida más limitado que muchos

antibióticos usados clínicamente. Por ejemplo, se ha descrito que las bacteriocinas reconocen y por lo tanto actúan solamente en, miembros de una especie igual o estrechamente relacionada uniéndose a receptores en organismos sensibles, o susceptibles.

A modo de clasificación amplia, las bacteriocinas se han dividido en tres tipos. Las primeras son moléculas pequeñas que son estables térmicamente. Los ejemplos de este primer tipo incluyen colicina V (siendo las colicinas específicas para bacterias coliformes). El segundo tipo, las piocinas de tipo S producidas por P. aeruginosa, son moléculas proteicas de mayor peso molecular. El tercer tipo incluye bacterocinas que se asemejan genéticamente y morfológicamente a las porciones de cola de los bacteriófagos. Los ejemplos de este último tipo incluyen las piocinas de tipo F y de tipo R de P. aeruginosa así como enterocoliticina de Yersinia. Se ha descrito que estas piocinas se derivan de un bacteriófago ancestral y tienen similitudes con la familia del fago lambda y con la familia del fago P2, respectivamente.

Las piocinas de tipo R son similares a las porciones de cola no flexibles y contráctiles de bacteriófagos de la familia myoviridae y están codificadas en un solo conjunto de genes en el genoma de Pseudomonas (Shinomiya et al., 1983). Véase la Figura 1. Después de unirse específicamente a una bacteria diana, estas piocinas forman un poro en la célula bacteriana, comprometiendo la integridad de su membrana citoplasmática y provocando la despolarización de la membrana. Las piocinas de tipo F también son similares a una cola de bacteriófago pero tienen una estructura de tipo varilla flexible y no contráctil. Las piocinas se producen en la mayoría de cepas de P. aeruginosa y algunas cepas sintetizan más de una piocina.

Las piocinas de tipo R son bacteriocinas complejas de elevado peso molecular producidas por algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa y tienen actividad bactericida contra otras cepas determinadas de P. aeruginosa (para una revisión véase Michel-Briand y Baysse, 2002). Hasta la fecha se han identificado cinco piocinas de tipo R y basándose en su espectro diana (véase más adelante), se denominan de R1 a R5. La cepa PA01 produce piocina R2, que está codificada por un conjunto de genes que consiste en 16 fases abiertas de lectura (ORF), 12 de las cuales muestran una similitud de secuencia significativa con las ORF de los bacteriófagos P2, PS17, <t>CTX y otros fagos similares a P2 (Nakayama et al., 2000). La producción de piocina se induce por daño en el ADN (Matsui et al., 1993) y está regulada por RecA, que degrada PrtR, el represor de PrtN, un regulador positivo de la transcripción del conjunto. La inducción de los genes de piocinas da como resultado la síntesis de aproximadamente 200 partículas de piocina por célula bacteriana seguida de la lisis de la célula mediante mecanismos similares a aquellos de la lisis por bacteriófagos. Las piocinas eliminan rápida y específicamente células diana uniéndose en primer lugar al lipopolisacárido (LPS) a través de sus fibras caudales, seguido... [Seguir leyendo]

1. Una proteína bacteriocina de fibra caudal de elevado peso molecular (epm) que comprende una reglón de anclaje a placa base (BPAR) y un dominio de unión a receptor heterólogo (RBD), en la que RBD es de una fibra caudal de un bacteriófago o protofago o una fibra caudal de otra bacteriocina que muestre características de unión diferentes de aquellas de la bacteriocina del BPAR y en la que BPAR comprende los aminoácidos 1-164 o 1-240 de una

piocina de tipo R.

2. La proteína de fibra caudal de la reivindicación 1 en la que dicho RBD es de una proteína de fibra caudal de

bacteriófago.

3. La proteína de fibra caudal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en la que dicho RBD de un bacteriófago o una bacteriocina comprende de 347 a 755 aminoácidos de longitud incluyendo el extremo C-terminal de dicha proteína.

4. La proteína de fibra caudal de la reivindicación 1 que comprende parte de la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID N°: 1, 3, 5, 7 o 9, o que comprende la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID N°: 27 o 30, o en el que el RBD se une a un factor de virulencia o aptitud bacteriano.

5. La proteína de fibra caudal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el RBD es de un fago T-4, un fago T-par, un fago seudoT-par, un fago T3, un fago T7, un fago del supergrupo de T7, fago Mu, fago P22, fago L- 413c o un fago lamboide.

6. Una bacteriocina de epm que comprende una proteína de fibra caudal de la reivindicación 5.

7. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fibra caudal de bacteriocina de elevado peso molecular (epm) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la expresión de la molécula de ácido nucleico está bajo el control de un promotor para su expresión en bacterias de producción.

8. Una célula bacteriana transfectada o transformada con, o que contiene, un vector de acuerdo con la reivindicación 7.

9. La célula bacteriana de la reivindicación 8, en la que la célula contiene una molécula de ácido nucleico que codifica y es capaz de expresar un conjunto de genes de piocina de tipo R a partir del cual se han inactivado o eliminado los genes prtR, prtN, prf15 y holin.

10. La célula bacteriana de la reivindicación 8, en la que la célula comprende además más de una molécula de ácido nucleico para la expresión de más de una proteína de fibra caudal modificada o diseñada por ingeniería genética para producir fibras caudales homotriméricas mixtas o fibras caudales heterotriméricas en la bacteriocina.

11. Una composición antibacteriana que comprende la bacteriocina de epm diseñada por ingeniería genética de la reivindicación 6 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración tópica, pulmonar, gastrointestinal o sistémica.

12. La composición de la reivindicación 11 que además comprende otra bacteriocina de epm diseñada por ingeniería genética o una bacteriocina de origen natural.

13. La composición de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que la bacteriocina está microencapsulada.

14. Un método para producir una bacteriocina de epm diseñada por ingeniería genética, comprendiendo dicho método cultivar la célula bacteriana de las reivindicaciones 8 a 10 en condiciones que den como resultado la producción de la bacteriocina de epm.

15. Un bacteriófago P2, P4 o OCTX que comprende la molécula de ácido nucleico definida en la reivindicación 7.

16. Un método in vitro o ex vivo para comprometer la integridad de una membrana citoplasmática de una célula bacteriana, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha bacteria con la bacteriocina de la reivindicación 6.

17. Una bacteriocina de la reivindicación 6 para su uso en un método para comprometer la integridad de una membrana citoplasmática de una célula bacteriana en un sujeto.