Autoanticuerpos humanos anti alfa-sinucleina.

Un anticuerpo monoclonal humano anti-α-sinucleína o su fragmento de unión a α

-sinucleína; en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a α-sinucleína comprende en su región variable una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 31-35 de la SEC ID Nº 9, una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 50-68 de la SEC ID Nº 9, una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 101-102 de la SEC ID Nº 9, una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 23-33 de la SEC ID Nº 12, una región VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 49-55 de la SEC ID Nº 12, una región VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 88-89 de la SEC ID Nº 12.

Autoanticuerpos humanos anti alfa-sinucleina Campo de la invención [0001] la presente invención se refiere en general a nuevas moléculas de unión específica a a-sinucleina, especialmente anticuerpos humanos así como sus fragmentos, derivados y variantes que reconocen la a-sinucleína y formas agregadas de a-sinucleína, respectivamente. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas y diagnósticas que comprenden dichas moléculas de unión, anticuerpos y sus miméticos válidos ambos como herramientas diagnósticas para identificar especies tóxicas de a-sinucleina en plasma y lCE y también en estrategias de vacunación pasiva para tratar trastornos relacionados con agregados de a-sinucleína, como la enfermedad de Parkinson (EP) , demencia con cuerpos de lewy (DCl) y variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras enfermedades sinucleinopáticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El plegamiento erróneo y la agregación de las proteínas son aspectos patológicos de numerosas enfermedades neurodegenerativas. los agregados de a-sinucleína son los componentes principales de los cuerpos de lewy y de las neuritas de lewy asociadas con la enfermedad de Parkinson (EP) . la a-sinucleina, una proteina desplegada en su forma nativa, puede adoptar diferentes morfologías agregadas, incluidos oligómeros, protofibrillas y fibrillas. Se ha demostrado que los agregados oligoméricos pequeños son especialmente tóxicos.

[00031 Se han detectado autoanticuerpos naturales frente a a-sinuc!eina en personas sanas y sus niveles alterados en los pacientes se asociaron con trastornos neurodegenerativos en particular; para revisión véase Neff y col., Autoimmun. Rev. 7 (2008) , 501-507. Por tanto, la apa rición de anticuerpos naturales en pacientes que sufren enfermedad de Parkinson, de forma espontánea o tras la vacunación, especialmente en pacientes sanos puede ofrecer un papel protector con respecto a la agregación de la a-sinudeina, véase. por ejemplo, Woulfe y col., Neurology 58 (2002) , 1435-1436 Y Papachroni y col., J. Neurochem. 101 (2007) , 749-756. Hasta ahora, el significado terapéutico de los autoanticuerpos ha sido dificil de evaluar. Esto se debe principalmente a la falta de técnicas experimentales directas para su aislamiento y posterior caracterización in vi/ro. Recientemente, se han publicados especies oligoméricas de a-sinucleína que están extracelularmente en plasma y lCE (EI-Agnaf y col., FASEB J. 20 (2006) , 419-425) Y estudios de inmunización en modelos murinos de EP muestran que los anticuerpos monoclonales de ratón extracelulares frente a a-sinucleina pueden reducir la acumulación de agregados intracelulares de 0

sinucleina (Masliah y col., Neuron, 46 (2005) , 857-868) lo que apoya la idea de que los anticuerpos que neutralizan los agregados neurotóxicos sin interferir con las funciones beneficiosas de la a-sinucleina monomérica pueden ser agentes terapéuticos útiles. Sin embargo, la utilidad terapéutica de los anticuerpos de base murina en humanos se ve limitada por la respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) debido a su origen no humano.

Emadi y col. en J. Mol. Biol. 368 (2007) , 1132-1144, describen el aislamiento de fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) a partir de una libreria de anticuerpos de despliegue de fagos a base de secuencias humanas frente a a-sinucleina, que se unen solo a una forma oligomérica de a-sinucleina e inhiben tanto la agregación como la toxicidad de dicha proteína in vitro. No obstante, aunque la generación de scFv a partir de despliegue de fagos es más bien sencilla, esta técnica tiene inconvenientes graves ya que los anticuerpos 45 producidos de este modo conllevan el riesgo de reactividad cruzada no deseada frente a autoantígenos y carecen de las caracteristicas de los anticuerpos humanos naturales optimizados de forma evolutiva producidos por el sistema inmunitario humano. Adicionalmente, estos anticuerpos pueden no ser suficientemente específicos debido a la reactividad cruzada con otras proteinas ylo con la proteína diana en el contexto de un entorno fisiológico y una función normales. En el caso de la enfermedad de Par1<inson, por ejemplo, los anticuerpos que también pueden 50 presentar reacción cruzada con derivados fisiológicos de a-sinucleina conllevan la posibilidad de producir efectos adversos relacionados con las funciones normales de las estructuras fisiológicas diana. A este respecto, una enfermedad autoinmune no deseada podria inducir realmente un riesgo difícil de calcular en el diseño conceptual de experimentos de inmunización activa empleando estructuras proteicas que, en su forma variante, también se producen fisiológicamente.

[00051 Más recientemente, Seitz y col. (81. Kongress der Deutschen Gesellschaft fur Neurologie mit Fortbildungsakademie Hamburg 10. 13.09.2008) comunicaron el aislamiento de autoanticuerpos policlonales anti-asinucleína a partir de diferentes soluciones de inmunoglobulinas y muestras de sangre de donantes individuales mediante cromatografia de afinidad. No obstante, a pesar del hecho de que esta técnica proporciona cantidades bastante limitadas del anticuerpo deseado, los anticuerpos policlonales tienen solo una aplicación terapéutica limitada debido, por ejemplo, a su heterogeneidad y al ries90 de estar contaminados con otras moléculas asociadas a a-sinucleina que tienen efectos adversos no deseados. De este modo, el valor diagnóstico de los anticuerpos policlonales se reduce ya que la variabilidad de la composición de los anticuerpos influirá sobre la especificidad y

reactividad globales. Esto es tanto más cierto para anticuerpos frente a proteinas objeto de agregación y depósito debido a un mal plegamiento.

Por tanto, existe la necesidad de superar las limitaciones descritas anterionnente y proporcionar un anticuerpo humano terapéutico y diagnóstico frente a la a-sinucleina.

RESUMEN DE LA INVENCiÓN

El problema técnico que subyace a la presente invención se ha resuelto mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención utiliza la respuesta inmune especifica frente a a-sinucleina en sujetos control de edad avanzada sanos y en pacientes con enfermedad neurológica para el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos naturales espeCíficos de a-sinucleina. En particular, los experimentos realizados según la presente invención fueron útiles para aislar anticuerpos monoclonales específicos de la a-sinucleína a partir de un colectivo de sujetos de edad avanzada sin signos de Parkinsonismo.

Por tanto, la presente invención está dirigida a anticuerpos humanos, fragmentos de unión al antígeno y moléculas de unión al antígeno similares que son capaces de reconocer específicamente a-sinucleína, donde el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleína comprende en su región variable una región VH CDR1 que 25 comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 31-35 de la SEC ID. N.O 9, una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 50-68 de la SEC ID N.O 9, una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 101-102 de la SEC ID N.O 9, una región VL CDR1 que comprende la secuencía de aminoácidos de los restos 23-33 de la SEC ID N.O 12, una región VL COR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 49-55 de la $EC ID N.O 12, una región VL CDR3 que 30 comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 88-89 de la $EC ID N.O 12. Por «reconociendo específicamente a-sinucleína», «anticuerpo especifico para/de a-sinuc!eína) ) y ( (anticuerpo anti-a-sinucleína» especialmente se entiende, en general, y colectivamente, anticuerpos frente a la fonna nativa de a-sinucleína, o frente a a-sinucleína mal plegada, oligomérica, agregada o postransduccionalmente modificada. En este documento se proporcionan anticuerpos humanos selectivos para las fonnas monoméricas nativas, de longitud completa,

truncadas y agregadas.

En una realización especialmente preferida de la presente invención, el anticuerpo humano o su fragmento de unión al antígeno muestra las características inmunológicas de unión de un anticuerpo caracterizado por las regiones variables VH y VL como se establecen en la figura 1 B.

El fragmento de unión al antígeno del anticuerpo puede ser un fragmento Fv de cadena sencilla, un fragmento F (ab') , un fragmento F (ab) y un fragmento F (ab') 2 o cualquier otro fragmento de unión al antígeno. En una realización especifica, más abajo, el anticuerpo o su fragmento es un anticuerpo humano de isotipo IgG. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico humano-murino o murinizado, siendo este último 45 especialmente útil... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano anti-a-sinucleina o su fragmento de unión a a-sinucleina; en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina comprende en su región variable una región VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los resto.

3. 35 de la SEC ID N° 9, una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos SO-68 de la $EC ID N° 9, una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los resto.

10. 102 de la SEC ID N° 9, una región VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de los resto.

2. 33 de la SEC ID N° 12, una región VL COR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de los resto.

4. 55 de la $EC ID N° 12, una región VL COR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de los resto.

8. 89 de la SEC ID N° 12.

2. El anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinUcleina de la reivindicación 1, en el que la región VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 9 Y la región VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 12.

3. El anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de la reivindicación 1, en el que la región VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 10 Y la región VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.O 13.

4. Un polinudeótido que codifica el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-a-sinucleina o su fragmento, comprendiendo dicho proced imiento

(a) cultivar la célula de la reivindicación 6 y

(b) aislar dicho anticuerpo o su fragmento a partir del cultivo.

8. Un anticuerpo anti-a-sinucleína o su fragmento codificado por el polinucleótido de la reivindicación 4 u obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 7.

9. El anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquier de las reivindicaciones 1 a 3 u 8, que está

(i) marcado detectablemente, donde el marcador detectable se selecciona a partir del grupo compuesto por una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo y un metal pesado o

(ii) unido a un fármaco.

10. Una composición que comprende el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9, el polinucleótido de la reivindicación 4, el vector de la reivindicación 5 o la célula de la reivindicación 6 en el que la composición es

(i) una composición farmacéutica que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable o

(ii) una composición diagnóstica que además comprende uno o más reactivos de diagnóstico inmunológicos o a base de ácido nucleico.

. El anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad sinucleinopática en un sujeto, en el que la enfermedad sinucleinopática se selecciona a partir del grupo compuesto por enfermedad de Parkinson (EP) , demencia por enfermedad de Parkinson (DEP) , demencia con cuerpos de Lewy (OCl) , la variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (VCLEA) , atrofia sistémica múltiple (ASM) , insuficiencia autonómica pura (IAP) , neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1) , enfermedad de Alzheimer, enfermedad

de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Hanervorden-$palZ) , esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y sindrome de Down.

12. El anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinuc!eína de la reivindicación 3 para su uso según la reivindicación 11, en el que la enfermedad sinucleinopatica es la enfermedad de Parkinson.

13. Un procedimiento de diagnóstico o control de la progresión de una enfermedad sinucleinopática en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

(a) evaluar el nivel de a-sinuc!eína en una muestra del sujeto que se va a diagnosticar con el anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9; y

(b) comparar el nivel de o-sinucleína con un patrón de referencia que indica el nivel de a-sinucleína en uno o más sujetos control,

en el que una diferencia o similitud entre el nivel de o-sinucleina y el patrón de referencia indica que el sujeto tiene una enfermedad sinuc!einopática, donde la enfermedad sinucleinopática se selecciona a partir del grupo compuesto por enfermedad de Parkinson (EP) , demencia por enfermedad de Parkinson (DEP) , demencia con cuerpos de lewy (DCl) , la variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (VClEA) , atrofia sistémica múltiples (ASM) , insuficiencia autónoma pura (IAP) , neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1) , enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Haliervorden-Spatz) , esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y síndrome de Down.

14. Un kit para el diagnóstico de una enfermedad sinucleinopática, comprendiendo dicho kit el anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9, el polinucleótido de la reivindicación 3, el vector de la reivindicación 5 y la célula de la reivindicación 6 con reactivos y/o instrucciones para su uso.

15. Una composición que comprende el anticuerpo o su fragmento de unión a o-sinucleina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9 unido a un agente terapéutico o de diagnóstico para su uso en la detección in vivo de 0sinucleína, o dirige un agente terapéutico y/o de diagnóstico hacia la a-sinucleína en el cuerpo humano o animal, donde la a-sinuclerna se detecta mediante tomografia de emisión de positrones (PETl, tomografía de emisión de fotón único (SPECT) , estudio por imagen óptica en el infrarrojo cercano (N IR) , estudio por imagen mediante resonancia magnética (MRI) o una combinación de los mismos.

16. Un procedimiento de seguimiento de la progresión de una enfermedad sinucleinopática o de la respuesta al tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica en un sujeto que comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinuclerna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 o 9; y

(b) detectar el anticuerpo o su fragmento de unión a a-sinucleína,

en el que la enfermedad sinucleinopática se selecciona a partir del grupo compuesto por enfermedad de Parkinson (EP) , demencia por enfermedad de Parkinson (DEP) , demencia con cuerpos de lewy (Del) , la variante con cuerpos de lewy de la enfermedad de Alzheimer (VClEA) , atrofia sistémica múltiple (ASM) , insuficiencia autonómica pura (IAP) , neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo 1 (NACH-1) , enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, distrofia neuroaxonal generalizada de inicio juvenil (enfermedad de Hanervorden-$patz) , esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral traumática y síndrome de Down.