Aparato y métodos para proporcionar esperma animal clasificado por sexo.

Un sistema para clasificar células espermáticas X e Y, estando el sistema caracterizado por que incluye:

un sistema de suministro de fluido de tasa variable para suministrar una corriente de fluido que contiene células espermáticas X e Y; una aparato de citometría de flujo para:

(1) recibir la corriente y formar gotitas que contienen las células espermáticas, incluyendo las gotitas primeras gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X, segundas gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas Y, y una tercera pluralidad de gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X y una o más células espermáticas Y;

(2) clasificar las primeras gotitas entre las segundas y terceras gotitas;

(3) recoger las primeras gotitas para proporcionar al menos una población de células espermáticas X; y

(4) identificar una cantidad de células espermáticas X en la al menos una población; y

un control sensible a instrucciones recibidas del aparato de citometría de flujo para variar la tasa a la cual se suministra el fluido al aparato de citometría de flujo como una función de la cantidad de células espermáticas X identificadas en dicha al menos una población respecto a la cantidad total de células X en las primeras, segundas y terceras gotitas, y en el que el control es funcional para aumentar la tasa de suministro de fluido cuando la cantidad de células X en dicha al menos una población está por encima de la cantidad aceptable y para disminuir la tasa de suministro de fluido cuando la cantidad de células X en dicha al menos una población está por debajo de la cantidad aceptable.

Aparato y métodos para proporcionar esperma animal clasificado por sexo

Antecedentes de la invención 5

Esta invención se refiere a aparatos y métodos para la recogida de semen animal, y más particularmente a aparatos y métodos que usan diversas técnicas, incluyendo citometría de flujo, para producir poblaciones de esperma que están enriquecidas con células espermáticas que tienen poblaciones viables de células espermáticas clasificadas de acuerdo con las características de ADN para su uso por la industria de producción animal para preseleccionar el 10 sexo de la descendencia animal.

La fertilización de animales por inseminación artificial (AI) y transplante de embriones después de fertilización in vitro es una práctica establecida. En la industria de producción de ganado, la capacidad de influir en el resultado reproductivo hacia descendencia que tenga una o más características deseadas tiene ventajas obvias. A modo de 15 ejemplo, sería un beneficio económico en la industria láctea preseleccionar la descendencia en favor del sexo femenino para asegurar la producción de vacas lecheras. Se han hecho esfuerzos hacia conseguir este objetivo usando citometría de flujo para clasificar células espermáticas X e Y, como se evidencia por las descripciones de las patentes de Estados Unidos Nº 6.357.307 (Buchanan, et al.) , 5.985.216 (Rens, et al.) , y 5.135.759 (Johnson) . Sin embargo, ninguno de estos esfuerzos ha provocado la introducción de un sistema de alto rendimiento 20 comercialmente satisfactorio capaz de producir volúmenes de producción de células espermáticas sexadas relativamente puras que tengan una movilidad suficiente para una fertilización eficaz.

Se han descrito instrumentos de clasificación celular en la técnica previa (véase, por ejemplo, "The EPICS ALTRA Flow Cytometer: Sorting Tutorial, " 2000,

www.beckmancoulter.com/literatureBioresearch/altra

www.bdciences.com/documents/BD

Otros han intentado desarrollar tecnología que pueda usarse para procesar células espermáticas para obtener poblaciones de células espermáticas que estén enriquecidas con esperma que tenga un cromosoma sexual deseado. Sin embargo, la tecnología existente está por debajo de las tecnologías de la invención descritas en este documento.

Por ejemplo, Johnson et al. (patente de Estados Unidos Nº 5.135.759) describe la separación de poblaciones de esperma que albergan el cromosoma X e Y intactos de acuerdo con el contenido de ADN usando un citómetro de flujo/clasificador celular en poblaciones enriquecidas de esperma que albergan el cromosoma X e Y. Como se ha descrito, el esperma se combina con un colorante ADN selectivo a una temperatura de 30 a 39º C durante un periodo de 1 hora (39º C) a 1, 5 horas (30º C) . Entonces se usa un citómetro de flujo para medir la cantidad de luz fluorescente 45 emitida según pasa el esperma a través de un haz láser que excita el colorante. Como el esperma que alberga el cromosoma X contiene más ADN que el esperma que alberga el cromosoma Y, teniendo la mayoría de las especies de mamíferos una diferencia de aproximadamente el 3 al 5%, el esperma que alberga el cromosoma X emite más luz fluorescente que el esperma que alberga el cromosoma Y. Para explicar el hecho de que la medición de fluorescencia puede variar dependiendo de la orientación rotatoria de las células espermáticas, se usan dos foto 50 detectores. El primero determina si las células espermáticas están orientadas apropiadamente, mientras que el segundo recoge la medición que se usa para clasificar el esperma como que tiene el cromosoma X o Y. Se usa un oscilador que provoca que la corriente que contiene el esperma se rompa en gotitas corriente abajo del sitio donde el esperma pasa a través del haz láser. A las gotitas que contienen esperma único de una intensidad fluorescente predeterminada se les da una carga y se desvían electrostáticamente en recipientes de recogida. La población de 55 esperma recogida enriquecida en género entonces se usa para microinyección, fertilización in vitro, o inseminación artificial.

Seidel et al. (documento WO 02/43574) también describe la separación de esperma en poblaciones enriquecidas en género de células que albergan el cromosoma X e Y usando citometría de flujo. Seidel et al. describe la tinción de 60 las células a una temperatura entre 30º C y 40º C.

La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2003/0157475 A1 (Schenk, 21 de agosto de 2003) describe un método para crioconservar células espermáticas que se han clasificado de acuerdo con el contenido de cromosoma X o Y. Como se indica en la misma, es deseable añadir un crioprotector a las células espermáticas 65 antes de crioconservarse para proteger a las células espermáticas durante el proceso de crioconservación. Por ejemplo, el glicerol es un crioprotector que se añade habitualmente a células espermáticas bovinas antes de la crioconservación. Sin embargo, para obtener mejor protección del crioprotector, es deseable esperar a que el crioprotector se equilibre con las células espermáticas antes de someter a las células espermáticas a temperaturas por debajo de 0º C. Durante el periodo de equilibrado, el crioprotector penetra en la membrana celular para proporcionar protección intra-celular además de cualquier protección extra-celular proporcionada por el crioprotector. 5 Por tanto, los métodos de crioconservación descritos en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nº 2003/0157475 A1 especifican que se añade un diluyente que contiene glicerol a las células espermáticas después de haberse refrigerado a aproximadamente 5º C. Entonces se permite que las células espermáticas y el glicerol se equilibren a 5º C durante cualquier periodo entre 1 y 18 horas antes de que las células espermáticas se sometan a temperaturas inferiores. La descripción recomienda un periodo de equilibrado entre tres y seis horas para obtener 10 los mejores resultados.

Desafortunadamente, el tiempo y coste implicados en un periodo de equilibrado de 3 a 6 horas tendrán un impacto negativo sobre la rentabilidad de un proceso comercial de clasificación de esperma. Además, en el contexto de un proceso comercial de clasificación de esperma, se cree que la salud del esperma se mejora de forma general 15 reduciendo el tiempo entre la recogida del esperma y la crioconservación (siendo equitativos otros factores) . Desde este punto de vista también, sería deseable tener acceso a tecnología de crioconservación que no requiera un largo periodo de equilibrado para obtener los beneficios óptimos de un crioprotector. Además, se ha informado de que la tecnología de crioconservación conocida tiene un impacto perjudicial sobre la motilidad del esperma, que es indicativa de fertilidad disminuida del esperma. Por tanto, existe la necesidad de técnicas de crioconservación que 20 conserven la salud del esperma en comparación con las técnicas convencionales.

Sumario de la invención

Esta invención se refiere a un sistema mejorado (métodos y aparato) para análisis, clasificación y ordenación por 25 contenido de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 7, 8, y 11.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama de flujo de trabajo para un proceso de clasificación de esperma ejemplar; 30

la Fig. 2 es un diagrama esquemático de un sistema de clasificación de gotitas por citometría de flujo;

la Fig. 3 es una vista lateral de un aparato de citometría de flujo para clasificación de gotitas que muestra un ensamblaje óptico de epi-iluminación que enfoca un haz de excitación sobre una corriente de fluido de movimiento 35 ascendente generado por un sistema de boquilla;

1. Un sistema para clasificar células espermáticas X e Y, estando el sistema caracterizado por que incluye:

un sistema de suministro de fluido de tasa variable para suministrar una corriente de fluido que contiene células espermáticas X e Y; una aparato de citometría de flujo para: 5

(1) recibir la corriente y formar gotitas que contienen las células espermáticas, incluyendo las gotitas primeras gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X, segundas gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas Y, y una tercera pluralidad de gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X y una o más células espermáticas Y;

(2) clasificar las primeras gotitas entre las segundas y terceras gotitas; 10

(3) recoger las primeras gotitas para proporcionar al menos una población de células espermáticas X; y (4) identificar una cantidad de células espermáticas X en la al menos una población; y un control sensible a instrucciones recibidas del aparato de citometría de flujo para variar la tasa a la cual se suministra el fluido al aparato de citometría de flujo como una función de la cantidad de células espermáticas X identificadas en dicha al menos una población respecto a la cantidad total de células X en las primeras, segundas y 15 terceras gotitas, y en el que el control es funcional para aumentar la tasa de suministro de fluido cuando la cantidad de células X en dicha al menos una población está por encima de la cantidad aceptable y para disminuir la tasa de suministro de fluido cuando la cantidad de células X en dicha al menos una población está por debajo de la cantidad aceptable.

2. Sistema para clasificar células espermáticas X e Y, estando el sistema caracterizado por que incluye:

un sistema de suministro de fluido de tasa variable para suministrar una corriente de fluido que contiene células espermáticas X e Y; un aparato de citometría de flujo para:

(1) recibir la corriente y formar gotitas que contienen las células espermáticas, incluyendo las gotitas primeras gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X, segundas gotitas que contienen, cada una, una o más 25 células espermáticas Y, y una tercera pluralidad de gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X y una o más células espermáticas Y, (2) clasificar las primeras y terceras gotitas entre las segundas gotitas, (3) recoger las primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de células espermáticas X, y (4) identificar una cantidad de células espermáticas Y en dicha al menos una población; 30

y un control sensible a instrucciones recibidas del aparato de citometría de flujo para variar la tasa a la cual se suministra el fluido al aparato de citometría de flujo como una función de la cantidad de células espermáticas Y identificadas en dicha al menos una población y en el que el control es funcional para variar la tasa a la cual se suministra fluido al sistema de citometría de flujo para mantener la pureza de dicha al menos una población a o por encima de una pureza deseada. 35

3. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que el control es funcional para aumentar la tasa de suministro de fluido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que la pureza deseada y para disminuir la tasa de suministro de fluido cuando la pureza es menor que la pureza deseada.

4. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3 caracterizado por que la pureza deseada es no mayor del 95%.

5. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la cantidad aceptable es al menos el 60% de la cantidad total de células X. 45

6. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que las células espermáticas X son células X vivas.

7. Un método para clasificar células espermáticas X e Y, comprendiendo el método: 50

suministrar una corriente de fluido que contiene células espermáticas X e Y a una primera localización y causar que la corriente se descomponga en gotitas en una segunda localización, incluyendo las gotitas:

a) primeras gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X;

b) segundas gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas Y; y c) una tercera pluralidad de gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X y una o más células 55 espermáticas Y;

clasificar las primeras y terceras gotitas entre las segundas gotitas;

recoger las primeras y terceras gotitas para proporcionar al menos una población de células espermáticas X;

identificar una cantidad de células espermáticas Y recogidas en dicha al menos una población; y variar la tasa a la cual se suministra fluido a la primera localización como una función de la cantidad de células espermáticas Y identificadas recogidas en dicha al menos una población para mantener la pureza de dicha al menos una población respecto a las células espermáticas X a o por encima de una pureza deseada.

8. Un método para clasificar células espermáticas X e Y, comprendiendo el método: 5

suministrar una corriente de fluido que contiene células espermáticas X e Y a una primera localización y causar que la corriente se descomponga en gotitas en una segunda localización, incluyendo las gotitas:

a) primeras gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X;

b) segundas gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas Y; y c) una tercera pluralidad de gotitas que contienen, cada una, una o más células espermáticas X y una o más células 10 espermáticas Y;

clasificar las primeras gotitas entre las segundas y terceras gotitas;

recoger las primeras gotitas para proporcionar al menos una población de células espermáticas X; identificar una cantidad de células espermáticas X recogidas en dicha al menos una población; y variar la tasa a la cual se suministra fluido a dicha primera localización como una función de la cantidad de células 15 espermáticas X identificadas recogidas en dicha al menos una población respecto a la cantidad total de células X en dichas primeras, segundas y terceras gotitas para mantener la cantidad de células espermáticas X recogidas en dicha al menos una población a o por encima de una cantidad aceptable respecto a la cantidad total de células X en las primeras, segundas y terceras gotitas.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que la pureza deseada es no mayor del 95%.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que el método incluye adicionalmente aumentar la tasa de suministro de fluido cuando la cantidad o porcentaje de células X recogidas en dicha al menos una población está por encima de la cantidad aceptable y disminuir la tasa de suministro de fluido cuando la 25 cantidad o porcentaje de células X recogidas en dicha al menos una población está por debajo de la cantidad aceptable.

11. Un método para clasificar células espermáticas X e Y usando citometría de flujo, comprendiendo el método: suministrar una corriente de fluido que contiene células espermáticas X e Y y causar que la corriente se 30 descomponga en gotitas;

examinar la corriente de fluido antes de que se descomponga en gotitas para identificar las células espermáticas que residirán en determinadas gotitas;

clasificar gotitas que contienen células espermáticas X de las gotitas que no tienen células espermáticas X;

recoger las gotitas que contienen células espermáticas X, incluyendo gotitas que contienen al menos una célula 35 espermática X y al menos una célula espermática Y; y variar la tasa a la cual se suministra la corriente de fluido como una función de la cantidad de células espermáticas Y identificadas recogidas en las gotitas que contienen células espermáticas X para mantener la pureza de las células espermáticas X recogidas en las gotitas que contienen células espermáticas X a o por encima de una pureza deseada. 40

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado por que las células espermáticas X son células vivas.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que la cantidad aceptable es al menos el 60% 45 de la cantidad total de células espermáticas X.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el método incluye adicionalmente aumentar la tasa de suministro de fluido cuando la pureza de dicha al menos una población es mayor que la pureza deseada y disminuir la tasa de suministro de fluido cuando la pureza es menor que la pureza deseada. 50