Aparato y procesos para proporcionar esperma animal clasificado por sexo.

Un sistema de citometría de flujo para clasificar una mezcla de partículas que incluye partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B,

comprendiendo el sistema un sistema de suministro de fluidos para suministrar un fluido que contiene las partículas, un aparato de citometría de flujo para recibir el fluido, conformarlo en una corriente y utilizar la citometría de flujo para organizar las partículas según las características, y un sistema de clasificación para clasificar las partículas según la organización y según una estrategia de clasificación para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, comprendiendo la mejora:

un control que responde a la información recibida del aparato de citometría de flujo para:

A) controlar el sistema de clasificación para variar su estrategia de clasificación como una función de: (1) la pureza de dicha población o poblaciones en relación con las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y

(2) la cantidad de las partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha población o poblaciones en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente y/o

(B) controlar el sistema de suministro de fluidos para variar la velocidad a la que se suministra el fluido como una función de la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha población o poblaciones en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente.

Aparato y procesos para proporcionar esperma animal clasificado por sexo Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a mejoras en el campo de la citometría de flujo a nivel más general. La citometría de flujo se puede definir ampliamente como la medida de las características de partículas individuales según pasan generalmente una a una en fila en una corriente fluida a través de un dispositivo de medida el cual, normalmente, proporciona información para clasificar las partículas de acuerdo con características seleccionadas. Opcionalmente, las partículas se pueden separar entonces en poblaciones utilizando una cualquiera de varias técnicas, incluida la clasificación de gotitas, clasificación por interferencia de gotitas y conmutación de fluidos. Otra opción es destruir selectivamente partículas no deseadas, por ejemplo, por ablación fotónica.

En un sistema de citometría de flujo de base óptica, la óptica se utiliza para dirigir y enfocar un haz de luz (p. ej., luz visible o luz UV) en la corriente que contiene las partículas y recoger emisiones procedentes de las partículas, incluida la dispersión de luz y/o emisión fluorescente procedente de las partículas. En un sistema óptico común, por ejemplo, un haz de luz (p. ej., un haz láser) se enfoca en la corriente y se recogen las emisiones mediante un par de unidades de recogida, una situada más adelante del láser para recoger las emisiones de luz dispersadas y otra situada ortogonalmente respecto a ambas corrientes y al láser para recoger las emisiones fluorescentes. Cada unidad de recogida incluye un fotodetector independiente, que aumenta el coste del sistema. Además, en los sistemas ópticos tradicionales los fotodetectores transforman las emisiones recogidas en señales eléctricas, que se analizan utilizando sistemas analógicos para clasificar las partículas de acuerdo con las características seleccionadas de las partículas. Los sistemas analógicos son relativamente baratos pero únicamente se puede derivar una información limitada a partir de las señales.

Otros han intentado desarrollar tecnología que pueda usarse para procesar células espermáticas para obtener poblaciones de células espermáticas que estén enriquecidas con esperma que tenga un cromosoma sexual deseado. Sin embargo, la tecnología existente está por debajo de las tecnologías de la invención descritas en este documento.

Por ejemplo, Johnson et al. (patente de Estados Unidos N° 5.135.759) describe la separación de poblaciones de esperma que albergan el cromosoma X e Y intactos de acuerdo con el contenido de ADN usando un citómetro de flujo/clasificador celular en poblaciones enriquecidas de esperma que albergan el cromosoma X e Y. Como se ha descrito, el esperma se combina con un colorante ADN selectivo a una temperatura de 30 a 39°C durante un periodo de 1 hora (39°C) a 1,5 horas (30°C). Entonces se usa un citómetro de flujo para medir la cantidad de luz fluorescente emitida según pasa el esperma a través de un haz láser que excita el colorante. Como el esperma que alberga el cromosoma X contiene más ADN que el esperma que alberga el cromosoma Y, teniendo la mayoría de las especies de mamíferos una diferencia de aproximadamente el 3 al 5%, el esperma que alberga el cromosoma X emite más luz fluorescente que el esperma que alberga el cromosoma Y. Para explicar el hecho de que la medición de fluorescencia puede variar dependiendo de la orientación rotatoria de las células espermáticas, se usan dos foto detectores. El primero determina si las células espermáticas están orientadas apropiadamente, mientras que el segundo recoge la medición que se usa para clasificar el esperma como que tiene el cromosoma X o Y. Se usa un oscilador que provoca que la corriente que contiene el esperma se rompa en gotitas corriente abajo del sitio donde el esperma pasa a través del haz láser. A las gotitas que contienen esperma único de una intensidad fluorescente predeterminada se les da una carga y se desvían electrostáticamente en recipientes de recogida. La población de esperma recogida enriquecida en género entonces se usa para microinyección, fertilización in vitro, o inseminación artificial.

Seidel et al. (documento WO 02/43574) también describe la separación de esperma en poblaciones enriquecidas en género de células que albergan el cromosoma X e Y usando citometría de flujo. Seidel et al. describe la tinción de las células a una temperatura entre 30°C y 40°C.

La publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2003/0157475 A1 (Schenk, 21 de agosto de 2003) describe un método para crioconservar células espermáticas que se han clasificado de acuerdo con el contenido de cromosoma X o Y. Como se indica en la misma, es deseable añadir un crioprotector a las células espermáticas antes de crioconservarse para proteger a las células espermáticas durante el proceso de crioconservación. Por ejemplo, el glicerol es un crioprotector que se añade habitualmente a células espermáticas bovinas antes de la crioconservación. Sin embargo, para obtener mejor protección del crioprotector, es deseable esperar a que el crioprotector se equilibre con las células espermáticas antes de someter a las células espermáticas a temperaturas por debajo de 0°C. Durante el periodo de equilibrado, el crioprotector penetra en la membrana celular para proporcionar protección intra-celular además de cualquier protección extra-celular proporcionada por el crioprotector. Por tanto, los métodos de crioconservación descritos en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2003/0157475 A1 especifican que se añade un diluyente que contiene glicerol a las células espermáticas después de haberse refrigerado a aproximadamente 5°C. Entonces se permite que las células espermáticas y el glicerol se equilibren a 5°C durante cualquier periodo entre 1 y 18 horas antes de que las células espermáticas se sometan a temperaturas inferiores. La descripción recomienda un periodo de equilibrado entre tres y seis horas para obtener

los mejores resultados.

Desafortunadamente, el tiempo y coste implicados en un periodo de equilibrado de 3 a 6 horas tendrán un impacto negativo sobre la rentabilidad de un proceso comercial de clasificación de esperma. Además, en el contexto de un proceso comercial de clasificación de esperma, se cree que la salud del esperma se mejora de forma general reduciendo el tiempo entre la recogida del esperma y la crioconservación (siendo equitativos otros factores). Desde este punto de vista también, sería deseable tener acceso a tecnología de crioconservación que no requiera un largo periodo de equilibrado para obtener los beneficios óptimos de un crioprotector. Además, se ha informado de que la tecnología de crioconservación conocida tiene un impacto perjudicial sobre la motilidad del esperma, que es indicativa de fertilidad disminuida del esperma. Por tanto, existe la necesidad de técnicas de crioconservación que conserven la salud del esperma en comparación con las técnicas convencionales.

El "The EPICS ALTRA flow cytometer: Sorting tutorial", 2000, describe un sistema de un citómetro de flujo que se construye de modo que al comienzo del proceso de clasificación se haya de escoger un modo de clasificación por parte del usuario y mantenerlo durante todo el proceso de clasificación. Por lo tanto, se puede seleccionar un modo de clasificación específico al comienzo del proceso de clasificación, operando cada uno de acuerdo a sus configuraciones estáticas durante todo el proceso de clasificación.

"BD FACSDiVa Option: White paper", 2002, describe parámetros estáticos similares para clasificar muestras mediante citometría de flujo. Este documento describe la arquitectura del hardware, cómo los componentes electrónicos digitalizan los datos, la mitología de la compensación y cómo los componentes electrónicos procesan los datos durante el proceso de clasificación. Además se describe que durante la clasificación, la velocidad de liberación del fluido se mantiene constante. El documento US 5998212 A describe un método y aparato para controlar de manera flexible las decisiones de clasificación para un citómetro de flujo o un instrumento similar a una relación de pureza respecto al rendimiento de las partículas clasificadas, particularmente con tasas de eventos elevadas. Además, describe tres estrategias de clasificación que el usuario puede seleccionar, que es una decisión de clasificación estática antes de la clasificación.

El documento de Hoffmann RA y Haick DW "cell separation using flow cytometric cell sorting" en: Recktenwald D, Radbruch A "cell separation methods and applications" 1998, Marcel Decker, páginas 237-270 describe la separación de células utilizando... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de citometría de flujo para clasificar una mezcla de partículas que incluye partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, comprendiendo el sistema un sistema de suministro de fluidos para suministrar un fluido que contiene las partículas, un aparato de citometría de flujo para recibir el fluido, conformarlo en una corriente y utilizar la citometría de flujo para organizar las partículas según las características, y un sistema de clasificación para clasificar las partículas según la organización y según una estrategia de clasificación para proporcionar al menos una población que contiene las partículas deseadas, comprendiendo la mejora:

un control que responde a la Información recibida del aparato de citometría de flujo para:

A) controlar el sistema de clasificación para variar su estrategia de clasificación como una función de:

(1) la pureza de dicha población o poblaciones en relación con las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y

(2) la cantidad de las partículas con la característica A o las partículas con la característica B en dicha población o poblaciones en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente y/o

(B) controlar el sistema de suministro de fluidos para variar la velocidad a la que se suministra el fluido como una función de la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en dicha población o poblaciones en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente.

2. Un sistema tal como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque el control es un procesador que implementa una estrategia de control que es una serie de algoritmos que controlan variables del sistema tales como la velocidad de suministro de fluidos y/o parámetros de clasificación.

3. Un sistema tal como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque las partículas son células espermáticas y por que la característica A es indicativa de una célula espermática X viva.

4. Un sistema tal como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, caracterizado por que el control es para incrementar la velocidad de suministro de fluidos cuando la pureza es mayor que una pureza deseada y para disminuir la velocidad de suministro de fluidos cuando la pureza es menor que la pureza deseada.

5. Un método para utilizar un sistema de citometría de flujo tal como se reivindica en la reivindicación 1 para clasificar una mezcla de partículas que incluye partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B.

6. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 5, caracterizado porque el control es un procesador que implementa una estrategia de control que es una serie de algoritmos que controlan variables del sistema tales como la velocidad de suministro de fluidos y/o parámetros de clasificación.

7. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado por que las partículas son células espermáticas, y por que la característica A es indicativa de una célula espermática X viva.

8. Un método tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que el método comprende además incrementar la velocidad de suministro de fluidos cuando dicha pureza es más grande que una pureza deseada y disminuir la velocidad de suministro de fluidos cuando dicha pureza es menor que la pureza deseada.

9. Un sistema para clasificar una mezcla de partículas que incluye partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, comprendiendo el sistema:

un sistema de suministro de fluidos para suministrar una corriente fluida que contiene las partículas;

un aparato de citometría de flujo para recibir la corriente, formar gotitas que contienen las partículas y clasificar las gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de clasificación, Incluyendo las gotitas unas primeras gotitas cada una conteniendo una o más partículas que tienen la característica A, unas segundas gotitas cada una conteniendo una o más partículas que tienen la característica B y unas terceras gotitas cada una conteniendo una o más partículas que tienen la característica A y una o más partículas que tienen la característica B; y

un control que responde a la información recibida del aparato de citometría de flujo para:

A) controlar el aparato de citometría de flujo para vahar la estrategia de clasificación como una función de:

(1) la pureza de al menos una población de gotitas en relación con las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y

(2) la cantidad de las partículas con la característica A o las partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente

y/o

B) controlar el sistema de suministro de fluidos para variar la velocidad a la que se suministra el fluido como una función de la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente.

10. Un sistema tal como se reivindica en la reivindicación 9, caracterizado por que el control es un procesador que implementa una estrategia de control que es una serie de algoritmos que controlan variables del sistema tales como la velocidad de suministro de fluidos y/o parámetros de clasificación.

11. Un sistema tal como se reivindica en la reivindicación 9 o la reivindicación 10, caracterizado porque el control es para controlar el sistema de suministro de fluidos para mantener la velocidad a la cual se suministra el fluido como contante, y por que el control es para variar la estrategia de clasificación.

12. Un sistema tal como se reivindica en la reivindicación 11, caracterizado por que el control es para variar la estrategia de clasificación con el fin de variar el porcentaje de las terceras gotitas en una de las poblaciones de gotitas.

13. Un sistema tal como se reivindica en la reivindicación 9 o la reivindicación 10, caracterizado porque el control es para controlar el sistema de suministro de fluidos para variar la velocidad a la cual se suministra el fluido como una función de la cantidad de partículas con la característica A en dicha población o poblaciones de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A en la corriente.

14. Un sistema tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado por que las partículas son células espermáticas, y porque la característica A es indicativa de una célula espermática X viva.

15. Un sistema tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado por que la relación de partículas con la característica A respecto a las partículas con la característica B en la mezcla es una relación conocida, y donde el control se puede operar para clasificar algunas de las partículas como que tienen la característica A o la característica B y para variar la velocidad de suministro de fluidos como una función de la relación de partículas clasificadas respecto a la relación conocida.

16. Un sistema tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado por que el control es para determinar una pureza de las partículas clasificadas basándose en señales de salida del aparato de citometría de flujo, comprendiendo además el sistema una entrada del operador al control para indicar una pureza deseada, y donde el control es para variar la velocidad de modo que la pureza de dicha población o poblaciones de gotitas corresponda a la pureza deseada.

17. Un método de clasificación de una mezcla de partículas que incluye partículas que tienen una característica A y partículas que tienen una característica B, comprendiendo el método:

suministrar una corriente fluida que contiene las partículas;

formar gotitas que contienen las partículas;

clasificar las gotitas en diferentes poblaciones según una estrategia de clasificación, incluyendo las gotitas unas primeras gotitas cada una conteniendo una o más partículas que tienen la característica A, unas segundas gotitas cada una conteniendo una o más partículas que tienen la característica B y unas terceras gotitas cada una conteniendo una o más partículas que tienen la característica A y una o más partículas que tienen la característica B; y

A) variar la estrategia de clasificación como una función de:

(1) la pureza de al menos una población de gotitas en relación con las partículas con la característica A o las partículas con la característica B; y

(2) la cantidad de las partículas con la característica A o las partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente;

y/o

B) variar la velocidad a la que se suministra el fluido como una función de la cantidad de partículas con la característica A o partículas con la característica B en al menos una población de gotitas en relación con la cantidad total de partículas con la característica A o partículas con la característica B en la corriente.