Suspensiones de espermatozoides para clasificación en poblaciones enriquecidas portadoras del cromosoma X o Y.

Un método de producción de una suspensión de células espermáticas no humanas enriquecidas en géneroque comprende:

(a) mezclar una suspensión de células espermáticas no humano con una composición que inhibe la motilidadde las células espermáticas no humano y comprende una ratio molar de potasio a sodio mayor que 1:1,respectivamente, y a continuación con una composición que regula las reacciones de oxidación/reducciónintracelular y/o extracelularmente seleccionada del grupo constituido por piruvato, vitamina K, ácido lipoico,glutatión, flavinas, quinonas, superóxido-dismutasa (SOD) y miméticos de SOD;

(b) teñir la suspensión de células espermáticas no humanas inmóviles con un tinte selectivo del DNA durantemenos de 160 minutos y a una temperatura de 4ºC a 30ºC; y

(c) clasificar la suspensión de células espermáticas no humanas inmóviles teñidas para formar una poblaciónde inseminación viable enriquecida en género de células espermáticas no humanas portadoras delcromosoma X o portadoras del cromosoma Y que tienen tinte seleccionado de DNA asociado con su DNA; y

(d) retornar dichas células espermáticas no humanas a un estado activado, en donde al menos 20% de lascélulas reactivadas tienen una velocidad de paso, la velocidad progresiva, o ambas, que es al menos 50% dela velocidad de paso, la velocidad progresiva, o ambas de las células espermáticas del eyaculado recientecomo se mide por análisis de esperma HTM-IVOS.

Suspensiones de espermatozoides para clasificación en poblaciones enriquecidas portadoras del cromosoma X o Y

La presente invención se refiere en general a un proceso de producción de una suspensión de células espermáticas no humanas enriquecidas en género que produce una suspensión de células espermáticas enriquecidas en género. De modo más específico, la presente invención se refiere a la preparación de suspensiones de células espermáticas que tienen motilidad reducida, y más particularmente una motilidad temporalmente reducida, con relación a los espermatozoides endógenos eyaculados, teniendo las suspensiones utilidad, por ejemplo, en un proceso de clasificar células espermáticas en una población enriquecida de células espermáticas portadoras del cromosoma X o Y.

La fertilización de los animales por inseminación artificial (AI) y el trasplante de embriones subsiguiente a la fertilización in vitro es una práctica establecida. En la industria de producción de ganado, la posibilidad de influir en el

resultado reproductivo hacia descendencia que tenga una o más características deseadas presenta ventajas obvias. A modo de ejemplo, se conseguiría un beneficio económico en la industria láctea preseleccionando la descendencia a favor del sexo femenino para asegurar la producción de vacas lecheras. La separación de los espermatozoides en poblaciones enriquecidas de células portadoras del cromosoma X e Y, conocidas como semen enriquecido en género o espermatozoides enriquecidos en género, es un método de consecución de descendencia preseleccionada.

Con objeto de obtener semen enriquecido en género, las células espermáticas deben teñirse con un tinte y clasificarse subsiguientemente en células portadoras de cromosoma X e Y. Cada uno de los procesos de tinción y clasificación causa un estrés en las células espermáticas que reduce la viabilidad o motilidad de las células espermáticas, particularmente la motilidad progresiva.

Salisbur y et al. describen una técnica para la recogida de semen de bovino eyaculado directamente en un diluyente que inhibe la motilidad celular y previene la absorción de carbohidratos del plasma seminal circundante. Cuando el eyaculado se recoge en el diluyente y la fase de aire por encima del líquido se reemplaza por gasificación con 100% CO2, las células en el eyaculado se vuelven inmóviles. Mientras las células se mantenían en el diluyente y se excluía el aire, las células permanecían inmóviles durante varias horas a la temperatura ambiente y durante al menos 8 días a 5ºC.

WO 02/41906 se refiere a un método de clasificación de células espermáticas para producir subpoblaciones enriquecidas en espermatozoides portadores de determinantes de cromosomas para descendencia masculina o femenina. En dicho método, las células espermáticas se exponen a cambios en temperatura y pH que afectan a la eficiencia de tinción y separación y la viabilidad (motilidad) de las células espermáticas.

La presente invención está dirigida a un método de producción de una suspensión de células espermáticas no humano enriquecidas en género como se caracteriza en la reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos La FIGURA 1 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 1 en donde la motilidad

progresiva porcentual de células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 600 μM a 28ºC en TCA que contiene piruvato 10 mM o en TCA protegido con atmósfera de dióxido de carbono que contiene piruvato 10 mM.

La FIGURA 2 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 1 en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 600 μM a 28ºC en TCA que contiene piruvato 10 mM o un inhibidor basado en carbonato a pH 7, 3.

La FIGURA 3 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 1 en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst

33342 600 μM a 28ºC en TCA que contiene piruvato 10 mM o un inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 4 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 2 en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 1000 μM a 28ºC en TCA que contiene piruvato 10 mM y diluidas luego 1 a 3 con TCA que contiene piruvato 10 mM o un inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 5 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 2 en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 1000 μM a 28ºC en (1) TCA que contiene piruvato 10 mM y diluidas 1 a 3 con el mismo o (2) un tampón 65 basado en carbonato a pH 7, 3 y diluidas 1 a 3 con inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 6 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 2 en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 1000 μM a 28ºC en TCA que contiene piruvato 10 mM o un inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 7 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 3 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 300 μM a 41ºC en TCA que contiene piruvato 10 mM y diluidas luego en ratio 1 a 3 con TCA que contiene piruvato 10 mM o con un inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 8 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 3 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 300 μM a 41ºC en (1) TCA que contiene piruvato 10 mM y diluidas 1 a 3 con el mismo o (2) un tampón basado en carbonato a pH 7, 3 y diluidas 1 a 3 con inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 9 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 3 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de las células espermáticas se mide para células espermáticas teñidas con tinte Hoechst 33342 300 μM a 41ºC en TCA que piruvato 10 mM o un inhibidor basado en carbonato a pH 6, 2.

La FIGURA 10 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 4 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides se mide para espermatozoides teñidos con tinte Hoechst 33342 400 μM a 41ºC en un tampón de TCA que contiene piruvato 10 mM.

La FIGURA 11 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 5 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides se mide para espermatozoides teñidos con tinte Hoechst 33342 400 μM a 41ºC en un tampón de TCA o un tampón de TCA que contiene vitamina K 10 μM.

La FIGURA 12 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 6 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides se mide para espermatozoides teñidos con tinte Hoechst 33342 400 μM a 41ºC en un tampón de TCA o un tampón de TCA que contiene vitamina K 100 μM.

La FIGURA 13 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 7 que no cae dentro del alcance de la presente invención, en donde la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides se mide para espermatozoides teñidos con tinte Hoechst 33342 400 μM a 41ºC en un tampón de TCA o un tampón de TCA que contiene ácido lipoico 1 mM.

La FIGURA 14 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 8 en donde la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides se mide para espermatozoides teñidos con tinte Hoechst 33342 600 μM a 28ºC en un tampón de TCA o un tampón de TCA que contiene piruvato 10 mM.

La FIGURA 15 representa gráficamente los resultados del estudio realizado en el Ejemplo 9 en donde la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides se mide para espermatozoides teñidos con tinte Hoechst 33342 600 μM a 28ºC en un... [Seguir leyendo]

1. Un método de producción de una suspensión de células espermáticas no humanas enriquecidas en género que comprende:

(a) mezclar una suspensión de células espermáticas no humano con una composición que inhibe la motilidad de las células espermáticas no humano y comprende una ratio molar de potasio a sodio mayor que 1:1, respectivamente, y a continuación con una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente seleccionada del grupo constituido por piruvato, vitamina K, ácido lipoico, glutatión, flavinas, quinonas, superóxido-dismutasa (SOD) y miméticos de SOD;

(b) teñir la suspensión de células espermáticas no humanas inmóviles con un tinte selectivo del DNA durante menos de 160 minutos y a una temperatura de 4ºC a 30ºC; y

(c) clasificar la suspensión de células espermáticas no humanas inmóviles teñidas para formar una población de inseminación viable enriquecida en género de células espermáticas no humanas portadoras del cromosoma X o portadoras del cromosoma Y que tienen tinte seleccionado de DNA asociado con su DNA; y

(d) retornar dichas células espermáticas no humanas a un estado activado, en donde al menos 20% de las células reactivadas tienen una velocidad de paso, la velocidad progresiva, o ambas, que es al menos 50% de la velocidad de paso, la velocidad progresiva, o ambas de las células espermáticas del eyaculado reciente como se mide por análisis de esperma HTM-IVOS.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la ratio molar de potasio a sodio es mayor que 1, 5:1, respectivamente.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la ratio molar de potasio a sodio es mayor que 1, 75:1,

respectivamente. 25

4. El método de la reivindicación 3, en donde la ratio molar de potasio a sodio es mayor que 2:1, respectivamente.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde el tinte se selecciona del grupo constituido

por Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, y el conjugado bisbencimida-BODIPY® 6-{[3- ( (2Z) -2-{[1 (difluoroboril) -3, 5-dimetil-1H-pirrol-2-il]-metileno}-2H-pirrol-5-il) propanoil]amino}-N-[3- (metil{3-