Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8.

Un anticuerpo humanizado que se une específicamente y antagoniza GDF-8,

que comprende: una región pesada variable (VH) de anticuerpo que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR), y una región ligera variable (VL) de anticuerpo que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR);

en el que:

dicho anticuerpo se une a GDF-8 con una Kd de 10-11 M o afinidad más elevada; y

en el que:

la primera CDR de una región de VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10, la segunda CDR de una región de VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 11, la tercera CDR de una región de VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 12, la primera CDR de una región de VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 13, la segunda CDR de una región de VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 14, y la tercera CDR de una región de VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15;

o en el que:

la primera CDR de una región de VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 20,

la segunda CDR de una región de VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21,

la tercera CDR de una región de VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 22,

la primera CDR de una región de VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 23,

la segunda CDR de una región de VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 24, y

la tercera CDR de una región de VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 25.

Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 6/79.74, presentada el 19 de agosto de 25.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

El campo técnico de la invención se refiere a antagonistas del factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF-8), en particular, anticuerpos contra GDF-8, por ejemplo, anticuerpos de ratón, humanos y humanizados y sus fragmentos, en particular los que inhiben la actividad de GDF-8 in vitro y/o in vivo. El campo se refiere adicionalmente al tratamiento, mejora, prevención, pronóstico, o control de trastornos asociados con GDF-8, por ejemplo, trastornos musculares, trastornos neuromusculares, trastornos degenerativos óseos, trastornos óseos metabólicos o inducidos, trastornos adiposos, trastornos del metabolismo de la glucosa o trastornos relacionados con la insulina, en particular esclerosis lateral amiotrófica ("ELA").

Técnica antecedente relacionada

El factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF-8), también denominado miostatina, es una proteína segregada y un miembro de la superfamilia del factor beta de crecimiento transformante (TGF-p) de factores de crecimiento relacionados estructuralmente. Los miembros de esta superfamilia poseen propiedades de regulación del crecimiento y mofogenéticas (Kingsley y col. (1994) Genes Dev. 8: 133-46; Floodless y col. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-72). El GDF-8 humano se sintetiza como una proteína precursora del aminoácido 375 que forma un complejo homodimérico. Durante el procesamiento, el propéptido amino-terminal, conocido como "péptido asociado a latencia" (LAP), se escinde y puede permanecer unido de forma no covalente al homodímero, formando un complejo inactivo denominado el "complejo latente pequeño" (Miyazono y col. (1988) J. Biol. Chem. 263: 647-15; Wakefield y col. (1988) J. Biol. Chem. 263: 7646-54; Brown y col. (1999) Growth Factors 3: 35-43; Thies y col. (21) Growth Factors 18: 251-59; Gentry y col. (199) Biochemistry 29: 6851-57; Derynck y col. (1995) Nature 316: 71-5; Massague (199) Ann. Rev. Cell Biol. 12: 597-641). Proteínas tales como folistatina y proteínas relacionadas con la misma también se unen a homodímeros GDF-8 maduros e inhiben la actividad biológica de GDF-8 (Gamer y col. (1999) Dev. Biol. 28: 222-32).

Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida de GDF-8 de diversas especies demuestra que GDF-8 está altamente conservado (McPherron y col. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12457-61). Las secuencias de GDF-8 de ser humano, ratón, rata, cerdo y pollo son idénticas en un 1 % en la región C-terminal, mientras que el GDF-8 de babuino, bovino y ovino difiere simplemente en 3 aminoácidos en el extremo C. El alto grado de conservación de GDF-8 entre especies sugiere que GDF-8 tiene una función fisiológica esencial.

Se ha mostrado que GDF-8 desempeña una función principal en la regulación del desarrollo y homeostasis muscular inhibiendo tanto la proliferación como la diferenciación de mioblastos y células satélite (Lee y McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 64-7; McCroskery, y col. (23) J. Cell. Biol. 162: 1135-47). Se expresa de forma precoz en músculo esquelético en desarrollo y continúa expresándose en músculo esquelético en adultos, preferentemente en tipos de contracción rápida. Además, GDF-8 sobreexpresado en ratones adultos da como resultado una pérdida muscular significativa (Zimmers y col. (22) Science 296: 1486-88). Además, se ha mostrado que las mutaciones naturales que inactiva en el gen de GDF-8 causan tanto hipertrofia como hiperplasia tanto en animales como en seres humanos (Lee y McPherron (1997) mencionado anteriormente/ Por ejemplo, ratones transgénicos genosuprimidos de GDF-8 se caracterizan por una hipertrofia e hiperplasia notables del músculo esquelético y por una estructura ósea cortical alterada (McPherron y col. (1997) Nature 387: 83-9; Hamrick y col. (2) Bone 27: 343-49). Aumentos similares en la masa del músculo esquelético son evidentes en mutaciones de GDF-8 naturales en ganado (Ashmore y col. (1974) Growth 38: 51-7; Swatland y col. (1994) J. Anim. Sci. 38: 752- 57; McPherron y col., mencionado anteriormente; Kambadur y col. (1997) Genome Res. 7: 91-15). Además, diversos estudios indican que el aumento de la expresión de GDF-8 está asociado con debilidad muscular inducida por VIH (Gonzalez-Cadavid y col. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14938-43). GDF-8 también se ha implicado en la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, creatina quinasa) y en la proliferación de mioblastos (documento WO /43781).

Además de sus propiedades de regulación del crecimiento y morfogenéticas, se cree que GDF-8 participa en otros numerosos procesos fisiológicos, incluyendo homeostasis de la glucosa durante el desarrollo de la diabetes de tipo 2, tolerancia alterada a la glucosa, síndromes metabólicos (es decir, un síndrome tal como, por ejemplo, síndrome X, que implican la aparición simultánea de un grupo de afecciones de la salud, que pueden incluir resistencia a la insulina, obesidad abdominal, dislipidemia, hipertensión, inflamación crónica, un estado protrombótico, etc., que pone a una persona en alto riesgo de diabetes de tipo 2 y/o enfermedad cardiaca), resistencia a la insulina (por ejemplo, resistencia inducida por traumatismos, tales como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), y trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad, dislipidemia, enfermedad de hígado graso no alcohólico, etc.) (Kim y col. (2) Biochem. Biophys. Res. Comm. 281: 92-6).

Una serie de trastornos humanos y animales están asociados con tejido muscular funcionalmente alterado, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica ("ELA"), distrofia muscular ("DM"; incluyendo distrofia muscular de Duchenne), atrofia muscular, atrofia de órganos, debilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (EPOC), sarcopenia, caquexia, y síndromes de debilidad muscular causados por otras enfermedades y afecciones. En la actualidad, existen pocas terapias de confianza o eficaces para tratar estos trastornos. La patología de estas enfermedades indica el papel potencial de la señalización de GDF-8 como una diana en el tratamiento de estas enfermedades.

La ELA es una enfermedad euro degenerativa de inicio tardío y mortal caracterizada por regeneración del sistema nervioso central y atrofia muscular. Por lo general, la ELA comienza con anomalías en marcha y pérdida de destreza, y a continuación progresa a parálisis de extremidades y diafragma. Aunque la mayoría de los casos de ELA son esporádicos y son de etiología desconocida, se ha mostrado que un 5-1 % de los casos resultan de herencia dominante familiar (FALS). Aproximadamente un 1-2 % de los casos de FALS se atribuyen a mutaciones en el gen de superóxido dismutasa con Cu/Zn (SOD1) (revisado en Bruijn y col. (24) Ann. Rev. Neurosci. 27: 723- 49). SOD1 es una metalo-proteína heterodimérica que cataliza la reacción de superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno diatómico, y como la pérdida de SOD1 no da como resultado enfermedad de neuronas motoras (Reaume y col. (1996) Nat. Genet. 13: 43-47), se cree que induce la enfermedad por aumento tóxico de la función (revisado en Bruijn y col., mencionado anteriormente). Los mecanismos específicos de muerte de células neuronales inducida por SOD1 no son claras, y pueden implicar alteraciones en el transporte axonal, respuestas celulares a proteína mal plegada, disfunción mitocondrial, y excitotoxicidad (Bruijn y col., mencionado anteriormente).

La degeneración de las neuronas motoras observadas en la ELA se puede producir a través de múltiples mecanismos, que incluyen la alteración de la absorción o transporte de factores tróficos por las neuronas motoras (revisado en Holzbaur (24) Trends Cell Biol. 14: 233-4). Por lo tanto, la ELA se podría tratar con terapias que rejuvenezcan una neurona en degeneración proporcionando un entorno óptimo de supervivencia. El entorno de un nervio incluye células no neuronales, tales como células gliales y musculares inervadas por las neuronas motoras. Este entorno proporciona factores tróficos y de crecimiento que endocita la neurona y se transportan a través de transporte axonal retrógrado al cuerpo celular (Chao (23) Neuron 39: 1-2; Holzbaur, mencionado anteriormente).

Se han realizado modelos de FALS tanto en ratón como en rata mediante la sobreexpresión de SOD1 mutante (Howland y col. (22) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99: 164-9). Ratones transgénicos que sobreexpresan la forma G93A de SOD1 mutante presentan debilidad y atrofia muscular de los... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente y antagoniza GDF-8, que comprende:

una región pesada variable (VH) de anticuerpo que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR), y una región ligera variable (VL) de anticuerpo que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR); en el que:

dicho anticuerpo se une a GDF-8 con una Kd de 1"11 M o afinidad más elevada; y en el que:

la primera CDR de una región de VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 1, la segunda CDR de una región de VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 11, la tercera CDR de una región de VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 12, la primera CDR de una región de VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 13, la segunda CDR de una región de VL (L2)

tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 14, y la tercera CDR de una región de VL (L3) tiene la

secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 15;

o en el que:

la primera CDR de una región de VH (H1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2, la segunda CDR de una región de VH (H2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 21, la tercera CDR de una región de VH (H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 22,

la primera CDR de una región de VL (L1) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 23,

la segunda CDR de una región de VL (L2) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 24, y la tercera CDR de una región de VL (L3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 25.

2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que dicha región de VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 7, y dicha región de VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 9.

3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una región constante de cadena pesada de un subtipo de ¡nmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE e IgM.

4. El anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una región constante de cadena pesada de lgG1 humana.

5. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que la región constante es alterada para modificar las propiedades del anticuerpo.

6. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 5, en el que la región constante alterada está mutada.

7. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que la región constante es alterada para aumentar o disminuir la unión al receptor de Fe.

8. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que la región constante comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 19.

9. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que la región constante de lgG1 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 19 mutada en uno o más de los restos 117 y 12 de la misma.

1. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende adicionalmente una región constante de cadena ligera del anticuerpo seleccionada entre el grupo que consiste en kappa y lambda.

11. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, unido de forma operativa a una secuencia de control de la expresión.

13. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12 como un antagonista de GDF-8.

14. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 13 o que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12 como un antagonista de GDF-8.

15. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que se une de forma específica a GDF-8, que comprende la etapa de cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 y recuperar el anticuerpo producido a partir de la misma.

16. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 producido mediante el procedimiento de la reivindicación 15.

17. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 y 16, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. La composición de la reivindicación 17 para su uso en el tratamiento de un trastorno de un sujeto mamífero, en el que el trastorno es seleccionado entre el grupo que consiste en: un trastorno muscular, un trastorno neuromuscular, un trastorno degenerativo óseo, un trastorno adiposo, un trastorno óseo metabólico, un trastorno óseo inducido, un trastorno del metabolismo de la glucosa, y un trastorno relacionado con la insulina.

19. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, en la que dicho trastorno es seleccionado adicionalmente entre el grupo de trastornos que consiste en: distrofia muscular, distrofia muscular de Duchenne, atrofia muscular, atrofia de órganos, debilidad, síndrome del túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), sarcopenia, caquexia, síndrome de debilitamiento muscular, osteoporosis, fractura relacionada con osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, masa ósea baja, tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina, diabetes del tipo 2, obesidad y síndrome metabólico.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicho trastorno es distrofia muscular de Duchenne.

21. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicho trastorno es ELA.

22. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en la que dicho trastorno es caquexia o sarcopenia.

23. La composición de la reivindicación 17 para su uso en el tratamiento de un trastorno de debilitamiento muscular

en un sujeto mamífero.

24. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 23, en la que el trastorno de debilitamiento muscular es un síndrome de debilitamiento muscular o debilitamiento muscular inducido por VIH.

25. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en la que dicho sujeto mamífero es un ser humano.

26. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 para su uso en un procedimiento de diagnóstico.