Anticuerpo de reacción cruzada contra Staphylococcus aureus.

Un anticuerpo con neutralización cruzada que neutraliza la toxina alfa (HIa) y al menos una de las toxinas de dos componentes de Staphylococcus aureus,

donde el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión poliespecífico que se une a la toxina alfa (Hla) y que se une a al menos una de las toxinas de dos componentes de Staphylococcus aureus.

Anticuerpo de reacción cruzada contra Staphylococcus aureus ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Staphylococcus aureus, un importante patógeno humano, expresa una multitud de toxinas de secreción (exotoxinas) que pueden destruir varios tipos celulares diferentes, entre los que se incluyen eritrocitos, granulocitos neutrófilos y otras células ¡nmunltarias, así como células epiteliales del pulmón o la piel. Además, la mayoría de estas toxinas activan a algunas células inmunitarias y actúan como potentes señales proinflamatorias.

Un miembro destacado de las citotoxinas de S. aureus es la hemolisina alfa (Hla), que ejerce una función citolítica sobre las células endoteliales y epiteliales de pulmón humanas, los linfocitos y los macrófagos. También puede Usar glóbulos rojos (GR) de conejo, pero es mucho menos tóxica para los GR humanos. La Hla se considera el factor de virulencia clave en la patogénesis de la neumonía por S. aureus y responsable de las lesiones tlsulares debidas a la lisis de células epiteliales pulmonares y al reclutamiento de células inmunitarias en grandes cantidades. Las células fagocíticas reclutadas, principalmente los granulocitos neutrófilos, se convierten en dianas de otras citotoxinas producidas por S. aureus durante la enfermedad. Las toxinas más potentes son las citolisinas de dos componentes, o leucocidinas, formadas por un componente L (de elución lenta) y un componente R (de elución rápida). Los productos del gen de la hemolisina gamma (Hlg) - expresados de forma universal por todas las cepas de S. aureus - pueden formar dos toxinas: HlgAB y HlgCB (la subunldad B es el componente R), siendo ambas muy potentes en la destrucción de células inmunitarias humanas: PMN, linfocitos y macrófagos. La primera también es una hemolisina muy potente para los GR humanos.

La leucocldlna de Panton Valentine (PVL), también denominada LukSF, es la toxina de dos componentes mejor caracterizada. La portan elementos genéticos derivados de fagos, y se produce por aproximadamente un 5-1% de las cepas de S. aureus aisladas de pacientes, sin embargo, se ha notificado que el porcentaje de células que expresan PVL es del 5-93% en las infecciones de la piel y los tejidos blandos, dependiendo del tipo de enfermedad (Lina, Clin Infecí Dls, 1999:1128). LukED (LukD es el componente R) es una leucocidina menos potente, pero se ha confirmado que está presente en la mayoría de los aislados clínicos de S. aureus (Shukla, J Clin Microbiol, 21:3582). Inicialmente, su actividad solo se asoció con infecciones de la piel, pero al ser la menos caracterizada entre las toxinas de dos componentes, no puede excluirse su contribución a otros tipos de infecciones por S. aureus. Recientemente se ha notificado que LukED está implicada en infecciones del torrente sanguíneo en un modelo murino de infección por S. aureus (Alonzo, Mol Microbiol, 212:423). Estos dos pares de genes comparten una homología significativa entre sí (identidad de aminoácidos del 68-82%), mientras que la leucocidina LukGH identificada recientemente (LukG es el componente R) tiene menor homología, con una identidad del 33-4% (Ventura, PloS ONE, 21:e11634; DuMont, Mol Microbiol, 211:814).

Se ha determinado la estructura cristalina de Hla, LukS, LukF, HlgA y HlgB, y ha revelado alguna homología estructural, a pesar del bajo nivel de homología de aminoácidos entre Hla y las subunidades de las toxinas de dos componentes que supone una identidad de aminoácidos del 16-28% (Galdiero, Protein Sc¡, 24:153; Pedelacq, Structure, 1999:277; Menestrina, FEBS Letters, 23:54). Todas estas toxinas forman una estructura parecida a un anillo formada por subunidades oligomerizadas, que lleva a la formación de poros dentro de la membrana celular y a la posterior citólisis. En el caso de Hla, se ha demostrado que el poro es heptamérico, pero en el caso de las toxinas de dos componentes, se han notificado heterooligómeros hexaméricos (Comai, Mol Microbiol, 22:1251), heptaméricos y octaméricos (Yamashita, PNAS, 211:17314), lo cual ha originado un debate dentro de la comunidad científica (revisado con detalle por Kaneko, Biosci Biotechnol Biochem, 24:981).

Los diferentes componentes R y L de esta familia de toxinas pueden formar no solo pares afines (siendo estos: LukS-LukF, LukE-LukD, HlgC-HIgB, HlgA-HIgB y LukH-LukG), sino también pares no afines, habiéndose notificado muchos de estos pares por Gravet et al. (Gravet, FEBS Letters, 1998:22) y por Dalla Serra et al. para las hemolisinas gamma y LukS (Dalla Serra, J Chem Inf Model, 25:1539). Debido a la redundancia y a la naturaleza promiscua de esta familia de toxinas, es poco probable que la inactivación de un solo componente sea eficaz para combatir las infecciones por S. aureus. Esta idea se confirma por observaciones indicadas en la bibliografía en las que la neutralización de una sola toxina de dos componentes solo afectaba parcialmente al fenotipo (por ejemplo, Ventura, PloS ONE, 21:e11634; Malachowa, PloS ONE, 211:e18617). Los estudios realizados en animales mostraron un impacto diferencial de las diversas toxinas de dos componentes sobre la supervivencia, dependiendo del modelo empleado o de la especie usada para los experimentos in vivo. Se observó la mayor reducción en la gravedad de la enfermedad cuando se eliminaron múltiples toxinas, por ejemplo, en un modelo de infección de ratón usando una cepa knock-out de S. aureus en la que se había inactivado el sistema Agr de detección de quorum, un regulador global de la expresión de toxinas (Kobayashi, J Infecí Dis, 211:24). Por lo tanto, es de esperar que mezclas de anticuerpos que neutralicen más toxinas ofrezcan una ventaja significativa en relación con los mAb con respecto a las toxinas individuales. Sin embargo, es difícil crear mezclas de anticuerpos monoclonales (mAb) que comprenden más de tres componentes.

Ohlsen et al. (International Journal of Medical Mlcroblology 3 (21) 42-41) describen estrategias ¡nmunoterapéuticas para combatir infecciones por estafilococos, por ejemplo, al describir anticuerpos específicos para Hla, o la neutralización de PVL por anticuerpos anti-PVL in vitro.

La probabilidad de encontrar anticuerpos sencillos que presentaran reacción cruzada entre la hemolisina alfa y cualquiera de las toxinas de dos componentes se consideró baja, basándose en la baja homología de secuencia (<3%) entre Hla y las toxinas de dos componentes. Es de esperar que sea mayor la posibilidad de encontrar anticuerpos sencillos que presenten reacción cruzada entre los componentes L y R, debido al mayor nivel de homología de secuencia, con la excepción de LukGH. Se ha descrito que el suero hiperinmunitario procedente de animales inmunizados con LukS puede reconocer HlgC, sin embargo, esto se debe a la presencia de diferentes especificidades en el suero policlonal. Laventie et al. (Laventie, PNAS, 211:1644) describieron un anticuerpo neutralizador bi-específico contra LukS y HlgC. Sin embargo, este tipo de anticuerpo no puede formar una fuerte interacción debido a que los sitios de unión en el antígeno afín son individuales. La reactividad cruzada de estos mAb bi-específicos normalmente está imitada a dos especificidades, es decir, no ofrece la posibilidad de neutralización cruzada amplia. En resumen, hasta la fecha no se ha notificado ningún mAb de reacción cruzada contra diferentes toxinas de S. aureus de dos componentes o contra la hemolisina alfa y cualquiera de las toxinas de dos componentes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo dirigido contra las diferentes citotoxinas de S. aureus con mejor potencia de reacción cruzada y neutralización cruzada.

El objeto se consigue con el contenido de la presente invención.

De acuerdo con la invención, se proporciona un anticuerpo de neutralización cruzada que neutraliza la toxina alfa (Hla) y al menos una de las toxinas de dos componentes de Staphylococcus aureus, donde el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión poliespecífico que se une a la toxina alfa (Hla) y que se une a al menos una de las toxinas de dos componentes de Staphylococcus aureus.

Específicamente, la toxina de dos componentes se selecciona del grupo que consiste en pares afines y no afines de componentes R y L de las hemolisinas gamma (HlgABC), PVL (LukSF) y toxinas parecidas a PVL, preferentemente cualquiera de HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukGH, LukS-HIgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukG-HIgA, LukEF, LukE-HIgB, HlgC-LukD o HlgC-LukF.

Preferentemente, el sitio de unión se une a al menos dos o a al menos tres toxinas de dos componentes, preferentemente a al menos dos o tres de cualquiera de HlgAB, HlgCB, LukSF y LukED, preferentemente a todas las siguientes: HlgAB, HlgCB, LukSF y LukED.

De acuerdo con una... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo con neutralización cruzada que neutraliza la toxina alfa (Hla) y al menos una de las toxinas de dos componentes de Staphylococcus aureus, donde el anticuerpo comprende al menos un sitio de unión poliespecífico que se une a la toxina alfa (Hla) y que se une a al menos una de las toxinas de dos componentes de Staphylococcus aureus.

2. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha toxina de dos componentes se selecciona del grupo que consiste en pares afines y no afines de componentes R y L de hemolisinas gamma, toxinas PVL y toxinas de tipo PVL, preferentemente cualquiera de HlgAB, HlgCB, LukSF, LukED, LukGH, LukS-HIgB, LukSD, HlgA-LukD, HlgA-LukF, LukG-HIgA, LukEF, LukE-HIgB, HlgC-LukD o HlgC-LukF.

3. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho sitio de unión se une a al menos dos o al menos tres toxinas de dos componentes, preferentemente a al menos dos o tres de cualquiera de HlgAB, HlgCB, LukSF y LukED, preferentemente HlgAB, HlgCB, LukSF y LukED.

4. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo monoclonal de longitud completa o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende al menos un dominio de anticuerpo que incorpora el sitio de unión, preferentemente, que tiene una afinidad para unirse a cada una de las toxinas con una Kd menor de 1'i) * * * * * * 8 M, preferentemente menor de 1"9M.

5. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo comprende las seis secuencias de CDR de un anticuerpo denominado #AB-24, comprendiendo dicho anticuerpo denominado #AB-24

(a) una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-LC cuya secuencia codificante está incluida en la célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26748; e

(b) una cadena pesada de anticuerpo denominada #AB-24-HC cuya secuencia codificante está incluida en la célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26747.

6. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo comprende

(a) una cadena ligera de anticuerpo producida por una célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26748; e

(b) una cadena pesada de anticuerpo producida por una célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26747;

7. Una célula hospedadora que comprende

(a) un casete de expresión que codifica una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-LC, estando dicha secuencia codificante incluida en la célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26748; y

(b) un casete de expresión que codifica una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-HC, estando dicha secuencia codificante incluida en la célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26747.

8. Método para producir un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que una célula hospedadora de acuerdo con la realización 7 se cultiva o se mantiene en condiciones para producir dicho anticuerpo.

9. Un método para identificar un anticuerpo protector candidato, que comprende:

(a) proporcionar una muestra que contiene un anticuerpo o célula productora de anticuerpos; y

(b) evaluar la competición cruzada de un anticuerpo presente en o producido por la muestra, denominándose el anticuerpo #AB-24, por la unión a la toxina alfa y a al menos una toxina de dos componentes de Staphylococcus aureus, donde la competición cruzada identifica al anticuerpo como un anticuerpo protector candidato, comprendiendo dicho anticuerpo denominado #AB-24

i) una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-LC, estando dicha secuencia codificante incluida en la

célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26748; y

ii) una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-HC, estando dicha secuencia codificante incluida en la

célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26747.

1. Un método para identificar un anticuerpo protector candidato, que comprende:

(a) proporcionar una muestra que contiene un anticuerpo o célula productora de anticuerpos; y

(b) evaluar la unión de un anticuerpo presente en o producido por la muestra a la toxina alfa y a al menos una toxina

de dos componentes de Staphylococcus aureus, donde una reacción positiva entre el anticuerpo y las toxinas

identifica al anticuerpo como un anticuerpo protector candidato.

11. Un método para producir un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende

(a) proporcionar un anticuerpo protector candidato identificado de acuerdo con la definición 19 o 2; y

(b) producir un anticuerpo monoclonal, o una forma humanizada o humana del anticuerpo protector candidato, o un

derivado del mismo que compite de forma cruzada con el anticuerpo denominado #AB-24 por la unión a la toxina

alfa y a al menos una toxina de dos componentes de Staphylococcus aureus, comprendiendo dicho anticuerpo denominado #AB-24

i) una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-LC, estando dicha secuencia codificante incluida en la 1 célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26748; y

¡i)una cadena ligera de anticuerpo denominada #AB-24-HC, estando dicha secuencia codificante incluida en la célula hospedadora depositada con el número de depósito DSM 26747.

12. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento de un sujeto con 15 riesgo de padecer o que padece una infección por S. aureus, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz

del anticuerpo para limitar la infección en el sujeto, para mejorar un estado patológico debido a dicha infección o para inhibir la patogénesis de la neumonía por S. aureus.

13. Preparación farmacéutica de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que 2 comprende preferentemente una formulación parenteral o para la administración en la mucosa, que contiene

opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso diagnóstico para detectar cualquier infección por S. aureus, incluyendo infecciones por SARM (S. aureus resistente a meticilina) que producen un alto nivel

de toxinas, tales como neumonía necrotizante, y la producción de toxinas en furunculosis y carbunculosis.

15. Preparación de diagnóstico de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que contiene opcionalmente el anticuerpo con un marcador y/o un reactivo de diagnóstico adicional con un marcador.