Procedimiento y aparato de análisis espectroscópico, en particular de alimentos, que emplea un tratamiento multivía de los datos espectroscópicos.

Procedimiento de análisis espectroscópico de al menos una muestra que emplea un método de análisis de datos espectroscópicos basado en un modelo estadístico multi-vía,

que incluye:

a) la iluminación de dicha muestra o de cada una de ellas que se va a analizar (E) mediante una pluralidad de radiaciones luminosas de excitación a sus respectivas longitudes de onda;

b) la adquisición de espectros de fluorescencia frontal (F280, F340, F429) de dicha muestra o de cada una de ellas, correspondiente cada uno a una radiación luminosa de excitación respectiva;

c) un tratamiento previo de los espectros de fluorescencia adquiridos;

d) para cada muestra, el cálculo de un vector de puntuaciones factoriales por aplicación a los espectros tratados previamente de dicho modelo estadístico multivía, identificado por un vector de factores de carga de excitación de la fluorescencia y por un vector de factores de carga de emisión; y

e) la determinación de al menos un parámetro escogido entre un indicador de calidad de dicha muestra o de cada una de ellas y un parámetro que caracteriza un procedimiento al cual dicha muestra o cada una de ellas se somete, a partir de dicho vector de puntuaciones factoriales;

estando el procedimiento caracterizado por que la separación espectral promedio entre dichas radiaciones luminosas de excitación es de al menos 50 nm, en una zona espectral de al menos 100 nm.

Procedimiento y aparato de análisis espectroscópico, en particular de alimentos, que emplea un tratamiento multivía de los datos espectroscópicos La invención trata sobre un procedimiento y un aparato de análisis espectroscópico de al menos una muestra, en particular de un alimento o medicamento, que emplea un método de análisis de datos espectroscópicos basado en un modelo estadístico multivía. En particular, la invención se puede aplicar al estudio de la evolución de las propiedades nutricionales (contenido en vitaminas…) y/o toxicológicas (contenido en contaminantes de neoformación…) de un alimento en el curso de su preparación o conservación, pero no solamente a ello. De manera más general, la invención se puede aplicar a la determinación ce cualquier indicador de calidad de una muestra y/o de cualquier parámetro que caracteriza un proceso al cual se somete dicha muestra.

Los contaminantes de neoformación (CNF) son moléculas nuevas formadas en un alimento a partir de componentes propios de ese alimento, debido a la acción de procesos de transformación y que presentan problemas de salud pública. Pocos laboratorios públicos o privados son capaces hoy día de determinar la dosis de estos contaminantes. Además, si bien se han publicado varios métodos para medir la cantidad de cada uno de estos contaminantes, ninguno de ellos ha sido objeto, realmente, de un proceso de estandarización y normalización. Por otra parte, estos análisis son costosos y el plazo de obtención de los resultados es largo (2 a 3 semanas) . La industria necesita métodos de análisis más rápidos y menos costosos para asegurar un control de la conformidad de sus procedimientos y de la seguridad de los alimentos que produce.

Los procesos de transformación alimentaria (cocción, esterilización, conservación) pueden también influir de manera desfavorable en las propiedades nutricionales de los alimentos, por ejemplo disminuyendo su cantidad de vitaminas. La caracterización de estos procesos y de su influencia sobre las propiedades nutricionales de los alimentos presenta problemas análogos a los citados previamente de determinación de cantidades de los contaminantes de neoformación.

Se sabe realizar análisis, en especial espectroscópicos, de los alimentos recurriendo a métodos de la quimiometría y, en particular, al análisis multivía. El análisis multivía es la ampliación natural del análisis multivariante cuando se disponen los datos en tablas de tres o más vías. Se basa en la utilización de modelos estadísticos tales como “PARAFAC” (“Parallel Factor”, es decir, modelo de factores paralelos) y NPLS (“Regresión de mínimos cuadrados parciales de n-vías”, por sus siglas en inglés) . Estos métodos, así como su aplicación al análisis de productos alimentarios, se describen en el documento [Bro 1998].

Más precisamente, [Rizkallah 2007] describe un método de análisis de muestras no preparadas (solamente molidas, si es necesario) basado en la aplicación del modelo PARAFAC a espectros de fluorescencia frontal (“front-face fluorescence”) . Este método conlleva la iluminación de una muestra por varios rayos luminosos monocromáticos de longitudes de onda respectivas y la adquisición de los espectros de fluorescencia correspondientes. Las radiaciones de excitación muestrean finamente (varios centenares de puntos) una zona espectral que cubre el visible y el UV próximo; a su vez, los espectros de emisión de fluorescencia son muestreados espectralmente (asimismo sobre varios centenares de puntos) . Los datos espectrales así recogidos para cada muestra se disponen en una matriz de grandes dimensiones denominada “matriz de excitación y emisión” (MEE) , en la cual una dimensión representa las longitudes de onda de excitación y la otra dimensión representa las longitudes de onda de emisión.

Las MEE que corresponden a varias muestras de calibrado son analizadas mediante el método PARAFAC el cual permite extraer informaciones, denominadas “factores PARAFAC” que corresponden a los perfiles bilineales de fluorescencia y a sus intensidades relativas. Luego, una regresión múltiple entre las intensidades de fluorescencia y las concentraciones de contaminantes de neoformación (o de otras sustancias de interés) medidas químicamente permiten construir un modelo de calibrado que se utiliza a continuación para predecir las concentraciones de contaminantes de neoformación a partir de las MEE recogidas de nuevas muestras para analizar.

Este método presenta dos limitaciones mayores:

-En primer lugar, necesita un equipamiento de elevado coste: un espectrofluorímetro equipado con una lámpara de xenón que proporciona el conjunto de las longitudes de onda desde el UV próximo hasta el visible y dos monocromadores capaces de hacer pasar estas diferentes longitudes de onda tanto en excitación como en emisión para los fotones emitidos por la muestra.

-En segundo lugar, su puesta en marcha es larga ya que, incluso si se evita la preparación de la muestra, la adquisición de cada EEM necesita de 15 a 45 minutos, según la resolución espectral buscada. El análisis de estas matrices de datos, que comprenden un número considerable de variables, es igualmente muy pesado, a pesar de la automatización de los algoritmos de tratamiento de datos.

Métodos similares son descritos por [Rizkallah et al., 2008] y [Christensen et al. 2005].

El documento [Nahorniak 2003] estudia la influencia de la resolución espectral (y por tanto del tamaño de la matriz EEM) sobre el error de predicción de la concentración de un fluoróforo por aplicación del método PARAFAC. En ese 2 10

documento se consideran disoluciones diluidas y de composición simple y conocida; además, todas las medidas se efectúan con una resolución espectral elevada, de 2 nm/pixel, siendo obtenida la reducción de resolución calculando medias espectrales.

Resulta, de este estudio, que se minimiza el error de predicción –y vale aproximadamente 0, 5–1 %-para una resolución en excitación de 6 a 10 nm/pixel; luego aumenta fuertemente para resoluciones inferiores (aumento de un factor 2 a 6 pasando a una resolución de 20 nm/pixel) . Parece por tanto difícil utilizar resoluciones inferiores a 20 nm/pixel.

La invención aspira a proporcionar un método de análisis más simple, más rápido, que necesite un equipo más sencillo y menos costoso y, en consecuencia, mejor adaptada a las exigencias industriales.

De acuerdo con la invención, se alcanza tal objetivo mediante un procedimiento de análisis espectrocópico según la reivindicación 1.

De manera ventajosa, el número de radiaciones luminosas de excitación y de espectros de fluorescencia correspondientes para cada muestra, puede estar comprendido entre dos y seis y, preferentemente, entre tres y cinco, en una zona espectral de al menos 100 nm y, preferentemente, de al menos 150 nm.

Este método es innovador debido a que aplica herramientas de análisis multivía como el modelo PARAFAC, normalmente utilizado para MEE de grandes dimensiones, a un conjunto constituido por un número limitado de espectros (generalmente dos a seis, preferentemente de tres a cinco) , muestreando de forma muy tosca la zona espectral de excitación de las muestras. Esta zona es relativamente amplia (al menos 100, incluso 150 nm, o más) porque la composición físicoquímica de dichas muestras es ampliamente desconocida y por tanto la posición exacta de los espectros de absorción de los fluoróforos contenidos en dichas muestras también lo es.

Los presentes inventores han descubierto, de manera sorprendente, que los modelos multivía continúan siendo aplicables y proporcionan resultados explotables incluso utilizando una resolución espectral en excitación tan tosca y un número tan restringido de longitudes de onda de excitación.

Es importante subrayar que, desde un punto de vista físico, los factores de carga o “loadings” representan los espectros de emisión o de excitación de cada factor y las puntuaciones factoriales o “scores” las intensidades de dichos factores. Un “factor PARAFAC” representa la contribución de un fluoróforo, o de una mezcla de fluoróforos, común a las muestras analizadas. Es preciso subrayar también que los espectros de fluorescencia son deformados por la interacción entre los fotones de excitación y los fotones emitidos con la matriz alimentaria y que no se satisface la condición de trilinealidad generalmente admitida para la aplicación del modelo PARAFAC. No obstante, los inventores han mostrado que este modelo se puede aplicar de forma útil a tales matrices EEM para describir... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de análisis espectroscópico de al menos una muestra que emplea un método de análisis de datos espectroscópicos basado en un modelo estadístico multi-vía, que incluye:

a) la iluminación de dicha muestra o de cada una de ellas que se va a analizar (E) mediante una pluralidad de radiaciones luminosas de excitación a sus respectivas longitudes de onda;

b) la adquisición de espectros de fluorescencia frontal (F280, F340, F429) de dicha muestra o de cada una de ellas, correspondiente cada uno a una radiación luminosa de excitación respectiva;

c) un tratamiento previo de los espectros de fluorescencia adquiridos;

d) para cada muestra, el cálculo de un vector de puntuaciones factoriales por aplicación a los espectros tratados previamente de dicho modelo estadístico multivía, identificado por un vector de factores de carga de excitación de la fluorescencia y por un vector de factores de carga de emisión; y

e) la determinación de al menos un parámetro escogido entre un indicador de calidad de dicha muestra o de cada una de ellas y un parámetro que caracteriza un procedimiento al cual dicha muestra o cada una de ellas se somete, a partir de dicho vector de puntuaciones factoriales;

estando el procedimiento caracterizado por que la separación espectral promedio entre dichas radiaciones luminosas de excitación es de al menos 50 nm, en una zona espectral de al menos 100 nm.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el cual el número de radiaciones luminosas de excitación y de espectros de fluorescencia correspondientes para cada muestra, está comprendido entre dos y seis, y preferentemente entre 3 y 5, en una zona espectral de al menos 100 nm y, preferentemente, de al menos 150 nm.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende asimismo una fase preliminar de calibrado que incluye:

i) la iluminación de varias muestras de calibrado por dichas radiaciones luminosas de excitación;

ii) la toma de los espectros de fluorescencia frontal de las muestras, que corresponden a dichas radiaciones luminosas de excitación;

iii) un tratamiento previo de los espectros de fluorescencia tomados;

iv) la determinación, mediante un método iterativo, de dichos vectores de los factores de carga de excitación y de emisión del modelo multivía, así como un vector de puntuaciones factoriales (“scores”) para cada muestra de calibrado y

v) la determinación de una función de regresión que enlaza dichos vectores de las puntuaciones a los valores, conocidos, de dicho o de cada parámetro para dichas muestras de calibrado.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual los espectros de fluorescencia son tratados previamente mediante sustracción de una contribución debida a la difusión Rayleigh de primer orden de la radiación luminosa de excitación, siendo calculada dicha contribución por medio de un modelo lineal generalizado.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el cual dicho modelo lineal generalizado se determina a partir de una primera parte o zona (RD) del espectro a tratar previamente, que comprende solamente dicha contribución debida a la difusión Rayleigh y que se utiliza para predecir la contribución de la difusión Rayleigh en una segunda parte o zona (RP) de dicho espectro en la cual se superpone a una contribución de fluorescencia.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el cual dicho modelo estadístico multivía es un modelo PARAFAC, estando representados los espectros de fluorescencia de cada muestra de forma concatenada.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 en el cual los vectores de los factores de carga de dicho modelo PARAFAC se determinan mediante un método iterativo que se detiene cuando la disminución de la función de pérdida debida a la última iteración se hace menor de un valor umbral comprendido entre 10-4 y 10-2 .

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dicho modelo estadístico multivía es un modelo NPLS, estando representados los espectros de fluorescencia de cada muestra en forma concatenada.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes en el cual dichas radiaciones luminosas de excitación comprenden:

-una primera radiación de una longitud de onda comprendida entre 270 y 300 nm;

- una segunda radiación de una longitud de onda comprendida entre 300 y 360 nm; y -una tercera radiación de una longitud de onda comprendida entre 400 y 500 nm.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes en el cual dicho parámetro o al menos uno de los que se van a determinar se escoge entre.

5. el contenido de dicha o de cada muestra en una sustancia de interés;

-una carga microbiana de dicha o de cada muestra; y -un valor de esterilización, de pasteurización o de cocción, o un producto tiempo-temperatura de un procedimiento al que dicha muestra o cada una de ellas se ha sometido.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes en el cual las muestras que se van a analizar 10 y las de calibrado son muestras de un producto escogido entre un alimento y un medicamento.

12. Uso de un procedimiento según la reivindicación 11 para medir la evolución de las propiedades nutricionales, microbiológicas y/o toxicológicas de un alimento en el curso de su preparación o conservación.

13. Aparato de análisis espectroscópico de al menos una muestra que incluye:

-un conjunto de fuentes luminosas (S1, S2, S3) para iluminar dicha muestra o cada una de las que se van a 15 analizar (E) mediante radiaciones luminosas de excitación respectivas, que presentan longitudes de onda diferentes con una separación espectral media de al menos 50 nm en una zona espectral de al menos 100 nm;

-un medio de adquisición (M, D) de los espectros de fluorescencia frontal emitidos por dicha muestra o por cada una de ellas cuando se ilumina por dichas radiaciones luminosas de excitación; y

-un medio de tratamiento (MTD) de los espectros de fluorescencia tomados, adaptado para llevar a cabo un 20 procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Aparato de análisis espectroscópico según la reivindicación 13 que tiene entre dos y seis de dichas fuentes luminosas y, preferentemente, entre tres y cinco.

15. Aparato según la reivindicación 14 que tiene: -una primera fuente luminosa (S1) que emite una radiación de una longitud de onda comprendida entre 270 y 300 25 nm;

-una segunda fuente luminosa (S2) que emite una radiación de una longitud de onda comprendida entre 300 y 360 nm; y -una tercera fuente luminosa (S3) que emite una radiación de una longitud de onda comprendida entre 400 y 500

nm. 30