Análisis de conjugados de fármacos y anticuerpos mediante espectrometría de masas con captura por afinidad basada en esferas.

Un método para detectar compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprende:

(i) procesar una muestra biológica recogida de una fuente biológica seleccionada de un mamífero, tejido, cultivo celular, plasma o suero previamente puestos en contacto con un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I:

Ab-(L-D)p I

en la que

Ab es un anticuerpo;

D es un resto de fármaco maitansinoide o monometilauristatina;

L es un enlazador unido covalentemente al Ab y unido covalentemente a D; y

p es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, para formar una muestra de análisis mediante formulación, inmovilización, centrifugación, aislamiento, digestión, inducción o prevención de la coagulación de las células sanguíneas, hidrólisis o purificación para formar una muestra de análisis procesada;

(ii) capturar la muestra de análisis procesada sobre esferas de inmunoafinidad que comprenden un antígeno específico para la muestra de análisis procesada, en donde la esfera de inmunoafinidad es una esfera paramagnética recubierta con estreptavidina;

(iii) eluir la muestra de análisis procesada;

(iv) aplicar la muestra de análisis eluida a un medio de separación para efectuar la separación de más de una muestra constituyente por cromatografía líquida de flujo capilar en donde un constituyente de la muestra separada comprende un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, en la que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8; y

(v) establecer la relación entre la masa y la carga de uno o más constituyentes de la muestra separados que es un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, en la que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, mediante espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESI).

Análisis de conjugados de fármacos y anticuerpos mediante espectrometría de masas con captura por afinidad basada en esferas

Referencia a soücítudes reiacíonadas

Esta solicitud no provisional presentada conforme a 37 CFR § 1.53(b), reivindica el beneficio conforme a 35 USC §119(e) sobre la solicitud provisional de EE-UU- n- de serie 61/052.727 presentada el 13 de mayo de 2008, que se incorpora por referencia en su totalidad.

Campo de ia invención

La invención se refiere en general a métodos para capturar, detectar, analizar, seleccionar, caracterizar y cuantificar compuestos conjugados de anticuerpos, incluyendo conjugados de anticuerpo-fármaco, y sus fragmentos y metabolitos, mediante espectrometría de masas. La invención también se refiere a métodos para preparar muestras para espectrometría de masas para estudios farmacocinéticos y toxicocinéticos.

Antecedentes de ia invención

Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son terapéuticas anticancerosas dirigidas diseñadas para reducir las toxicidades inespecíficas e incrementar la eficacia respecto a la molécula pequeña convencional y a la quimioterapia con anticuerpos para el cáncer. Emplean la potente capacidad para dirigir anticuerpos monoclonales para liberar específicamente terapéuticas de molécula pequeña conjugadas y altamente potentes frente a una célula cancerosa. Para evaluar las propiedades tales como la farmacocinética y la toxicidad de estos conjugados anticuerpo-fármaco, es útil ser capaz de caracterizar y cualificarlos a partir de plasma, orina y otras muestras biológicas. Además, la capacidad para cuantificar el fármaco libre (no conjugado con el anticuerpo) en el método de la misma muestra y la misma inyección cromatogràfica también sería útil.

Se han usado diversas técnicas de espectrometría de masas para la identificación y cuantificación de terapéuticas de moléculas pequeñas en los estudios farmacocinéticos, tales como: impacto de electrones (IE), ionización química (IQ), ionización química por desorción (IQD), bombardeo rápido con átomos (BRA), ionización por electropulverización (ESI), ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI) y espectrometría de masas en tándem (EM / EM) (Yao et al (2001) Jour, de Chrom B 752:9 - 16; Royer et al (1995) Rapid Comm. in Mass Spec. 9:495 - 502), incluyendo el modo de monitorización on ion único (SIM) de selección de iones para desconvolución (Souppart et al (2002) Jour. of Chrom. B 774:195 - 203; Wong et al (2001) Jour. of Chrom. 765:55 - 62; Yao et al (1998) Jour. of Chrom. B 718:77 - 85; Abdel-Hamid et al (2001) Jour. of Chrom. B 753:401 - 408; Marques et al (2001) Jour. of Chrom. 762:87 - 95). Estos métodos e instrumentación requieren la separación de los diversos analitos a partir de fluidos biológicos para la sensibilidad suficiente. Tal purificación puede ser muy laboriosa, lenta, y requerir grandes volúmenes de fluidos de muestra debido a la baja concentración de los analitos de interés en muestras, tales como medio de cultivo celular, plasma humano, orina y bilis.

La combinación directa de una etapa frontal de separación / aislamiento / purificación acoplada a detección / caracterización / cuantificación mediante espectrometría de masas es eficaz para los estudios metabólicos de muestras biológicas complejas. Normalmente, la CL / EM se utiliza para la caracterización de los anticuerpos (Martin et al (1997) Cáncer Chemother. Pharmacol. 40:189 - 201; documentos WO 03/046571; WO 03/046572), y se utiliza ELISA para la cuantificación en matrices biológicas (Murray et al (2001) J. Imm. Methods 255:41 - 56; Kirchneret al (2004) Clin. Pharmacokinetics 43(2):83 - 95). Normalmente los ensayos de ELISA son sensibles y susceptibles a tamizados de alto rendimiento.

Los recientes avances en el análisis de proteínas mediante espectrometría de masas (EM) se deben a las técnicas frontales de introducción e ionización en fase de gas tal como ionización por electropulverización (ESI), ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI, documento US 2003/0027216) e ionización de desorción láser con potenciación de superficie (SELDI, documento US 6020208), así como mejoras en la sensibilidad del instrumento, resolución, exactitud de la masa, bioinformàtica y algoritmos de desconvolución de datos en software ("Electrospray lonization Mass Spectrometry: Fundamentáis, Instrumentation, and Applications", Cole, R.B., Ed. (1997) Wiley, New York; "Modern Protein Chemistry: Practical Aspects", Howard, G.C. y Brown, W.E., Eds. (2002) CRC Press, Boca Ratón, FL, p. 71 - 102;). La estructura primaria (secuencia), secundaria y terciaria de las proteínas se puede sondar y deducir con EM. La ionización por electropulverización (ESI) proporciona la ionización a presión atmosférica (IPA) de una muestra de líquido. El proceso de electropulverización crea gotitas altamente cargadas que, en virtud de la evaporación, crean iones representativos de las especies contenidas en la solución. Un orificio de muestreo de iones de un espectrómetro de masas puede utilizarse para obtener muestras de estos iones en fase gaseosa para el análisis de masas. La respuesta para un analito medida mediante el detector de espectrómetro de masas depende de la concentración del analito en el fluido y es independiente del caudal del fluido.

Se han divulgado métodos para detectar y seleccionar conjugados anticuerpo-fármaco mediante captura en membrana de inmunoafinidad captura (MIA) y espectrometría de masas (documento US 2005/0232929).

Sumario

La invención incluye métodos para detectar, seleccionar y cuantificar compuestos conjugados de anticuerpos y composiciones de los mismos, mediante captura de inmunoafinidad con esferas, separación, cromatografía y espectrometría de masas como se define en las reivindicaciones.

La captura de inmunoafinidad con esferas se realiza con esferas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina que se centra en: (i) la fuerte interacción estreptavidina-biotina, (¡i) alta capacidad de unión para capturar material suficiente para el análisis de proteínas intactas, (i¡¡) baja unión no específica, (¡v) elución de los constituyentes de la muestra con disolventes compatibles con espectrometría de masas, (v) buena recuperación de la muestra y (vi) posibilidad de automatización.

La invención se refiere a compuestos conjugados de anticuerpos que tienen la Fórmula I:

Ab-(L-D)p I

en la que

Ab es un anticuerpo;

D es un resto de fármaco maitansinoide o monometilauristatina;

L es un enlazador unido covalentemente al Ab y unido covalentemente a D; y

p es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8.

Un aspecto de la invención incluye un método para detectar compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden:

(i) procesar una muestra biológica recogida de una fuente biológica seleccionada de un mamífero, tejido, cultivo celular, plasma o suero previamente puestos en contacto con un compuesto de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I:

Ab-(L-D)p

en la que

Ab es un anticuerpo;

Des un resto de fármaco maitansinoide o monometilauristatina;

L es un enlazador unido covalentemente al Ab y unido covalentemente a D; y

p es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8, para formar una muestra de análisis mediante la formulación, inmovilización, centrifugación, aislamiento, digestión, inducción o prevención de la coagulación de las células sanguíneas, hidrólisis o purificación para formar una muestra de análisis procesada;

(¡i) capturar la muestra de análisis procesada sobre esferas de inmunoafinidad que comprenden un antígeno específico para la muestra de análisis procesada, en la que la esfera de inmunoafinidad es una esfera magnética recubierta con estreptavidina;

(i¡¡) eluir la muestra de análisis procesada;

(iv) aplicar la muestra de análisis eluida a un medio de separación para efectuar la separación de más de una muestra constituyente por cromatografía líquida de flujo capilar en la que un constituyente de la muestra separada comprende un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, en la que p es 0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, o 8; y

(v) establecer la relación entre la masa y la carga de uno o más constituyentes de la muestra separados que es un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, en la que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, mediante espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESI).

La invención puede entenderse por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones de ejemplo, tomadas junto con los dibujos, figuras y ejemplos adjuntos. La discusión... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprende:

(i) procesar una muestra biológica recogida de una fuente biológica seleccionada de un mamífero, tejido, cultivo celular, plasma o suero previamente puestos en contacto con un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I:

Ab-(L-D)p

en la que

Ab es un anticuerpo;

D es un resto de fármaco maitansinoide o monometilauristatina;

L es un enlazador unido covalentemente al Ab y unido covalentemente a D; y

p es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, para formar una muestra de análisis mediante formulación, inmovilización, centrifugación, aislamiento, digestión, inducción o prevención de la coagulación de las células sanguíneas, hidrólisis o purificación para formar una muestra de análisis procesada;

(¡i) capturar la muestra de análisis procesada sobre esferas de inmunoafinidad que comprenden un antígeno específico para la muestra de análisis procesada, en donde la esfera de inmunoafinidad es una esfera paramagnética recubierta con estreptavidina;

(i¡¡) eluir la muestra de análisis procesada;

(¡v) aplicar la muestra de análisis eluida a un medio de separación para efectuar la separación de más de una muestra constituyente por cromatografía líquida de flujo capilar en donde un constituyente de la muestra separada comprende un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, en la que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7 u 8; y

(v) establecer la relación entre la masa y la carga de uno o más constituyentes de la muestra separados que es un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, en la que p es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, mediante espectrometría de masas con ionización porelectropulverización (ESI).

2. El método de la reivindicación 1 que comprende además repetir las etapas (i) a (v) una o más veces.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es sangre y la sangre se procesa para formar plasma o suero.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el antígeno es (i) un dominio extracelular (DEC) de una proteína receptora diana, o (¡i) un anticuerpo anti-fármaco.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el DEC o el anticuerpo anti-fármaco están biotinilados y el DEC biotinilado o el anticuerpo anti-fármaco se unen a esferas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina por inmunoafinidad.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la esfera de inmunoafinidad está configurada en un canal de flujo continuo en comunicación fluida con un depósito de recogida.

7. El método de la reivindicación 6, en el que

(i) la esfera de inmunoafinidad está configurada en un recipiente de flujo continuo, en el que la muestra de la fuente biológica es introducida en un extremo o un orificio, y una muestra está eluida en el otro extremo u orificio; o

(¡i) la esfera de inmunoafinidad está distribuida en una pluralidad de recipientes de flujo continuo, cada uno en comunicación con un depósito de recogida separada; o

(i¡¡) los vasos y los depósitos están configurados en un formato de 96 pocilios de microtitulación de 12 x 8 columnas y filas, o un formato de 384 pocilios de microtitulación de 24 x 16 columnas y filas.

8. El método de la reivindicación 1 que comprende además la etapa de tratar la muestra de análisis con un reactivo de desglicosilación.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de separación es un soporte de cromatografía.

10. El método de la reivindicación 11, en el que el soporte de cromatografía es un adsorbente de fase inversa.

11. El método de la reivindicación 10, en el que (i) la fase inversa es poliestireno, o un injerto o copolímero de poliestireno, o (¡i) un efluente desde el soporte de cromatografía se analiza de forma intermitente mediante espectrometría de masas para establecer la relación entre la masa y la carga de más de uno de los constituyentes aclarados separados.

12. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo del compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene la Fórmula I, o el fragmento de anticuerpo o el metabollto del mismo, se une a un antígeno asociado a tumor o a un receptor de la superficie celular en la fuente biológica.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo del compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco se une a uno o más antígenos asociados a tumores o a receptores de la superficie celular seleccionados de (1 )-(36):

(1) BMPR1 B (receptor de la proteína morfogenétlca ósea de tipo IB);

(2) E16 (LAT1, SLC7A5);

(3) STEAP1 (seis antígenos epiteliales transmembrana de próstata);

(4) 0772P (CA125, MUC16);

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenclador de megacarlocltos, mesotellna);

(6) Nap¡3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 de transportadores de soluto (fosfato sódico), transportador 3b de fosfato dependiente de sodio de tipo II, miembro 2);

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforlna 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondlna (tipo 1 y similar al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B);

(8) PSCA hlg (genes 2700050C12Rlk, C530008016Rlk, RIKEN ADNc 2700050C12, RIKEN ADNc 2700050C12);

(9) ETBR (receptor de tipo B de la endotellna);

(10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315);

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial de seis dominios transmembrana de la próstata 2, proteína prostética de seis dominios transmembrana);

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, potencial canal catiónico del receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4);

(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);

(14) CD21 (CR2 (receptor 2 del complemento) o C3DR (receptor C3d/del virus de Epstein Barr) o Hs 73792 n- de acceso en Genbank M26004);

(15) CD79b (CD79B, CD79[3, IGb (beta asociado a inmunoglobulina), B29);

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (proteína 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);

(17) HER2;

(18) NCA;

(19) MDP;

(20) IL20Ra;

(21) Brevican;

(22) Ephb2R;

(23) ASLG659;

(24) PSCA;

(25) GEDA;

(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de células B, receptor BLyS 3, BR3);

(27) CD22 (receptor de células B, ¡soforma CD22-B);

(28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa asociada con Inmunoglobulina);

(29) CXCR5 (receptor 2 del llnfoma de Burkltt);

(30) HLA-DOB (subunldad beta de la molécula de clase II del MHC (antígeno la));

(31) P2X5 (canal Iónico 5 dependiente de ligando P2X del receptor purlnérglco);

(32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de las células B, Lyb-2);

(33) LY64 (antígeno llnfocltarlo 64 (RP105));

(34) FCRH1 (proteína 1 similar al receptor de Fe);

(35) IRTA2 (receptor de la superfamllla de las ¡nmunoglobullnas 2 asociado a la translocación); y

(36) TENB2 (proteogllcano putativo transmembrana, relacionado con la familia de EGF/heregullna de factores de crecimiento y follstatlna.

14. El método de la reivindicación 1, en el que L está (I) formado a partir de un reactivo enlazador seleccionado de N-succln¡m¡d¡l-4-(2-p¡r¡d¡lt¡o) propanoato (SPDP), succln¡m¡d¡l-4-(N-male¡m¡domet¡l)c¡clohexano-1-carbox¡lato (SMCC) y N-succln¡m¡d¡l-4-(2-p¡r¡d¡ltlo)pentanoato (SPP), o (¡I) seleccionado de malelmldocaprollo (MC), malelmldopropanollo (MP) y malelmldocaproll-vallna-cltrullna-para-amlnobenclloxlcarbonllo (MC-vc-PAB).

15. El método de la reivindicación 1, en el que D es un maitansinoide, que tiene la estructura:

5 en la que la línea ondulada indica la unión covalente del átomo de azufre de D al enlazador (L) del conjugado anticuerpo-fármaco, R se selecciona independientemente de H y alquilo Ü1-Ü6, y m es 1,2 o 3.

16. El método de la reivindicación 15, en el que D es DM1, que tiene la estructura:

17. El método de la reivindicación 1, en el que D es una monometilauristatina.

18. El método de la reivindicación 17, en el que D es (i) MMAE, que tiene la estructura:

o (ii) MMAF, que tiene la estructura: