Alfa-amilasas variantes de Bacillus subtilis y sus métodos de uso.

Método para producir etanol a partir de un sustrato de almidón,

que comprende:

la licuefacción y sacarificación de un sustrato de almidón con el fin de producir glucosa mediante la puesta en contacto de dicho sustrato de almidón con un polipéptido AmyE con la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3,

en el que la licuefacción y la sacarificación se llevan a cabo en la misma mezcla de reacción sin un ajuste del pH;

comprendiendo dicho método la fermentación de dicha glucosa con el fin de producir etanol.

a-amilasas variantes de Baci llus Subtilis y sus métodos de uso CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se describen alfa-amilasas de Bacillus subtilis (AmyE) , variantes de estas, ácidos nucleicos que las codifican y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos. Se exponen métodos para utilizar AmyE o variantes de esta para la producción de etanol. En algunos casos, las amilasas pueden utilizarse con un pH bajo, en ausencia de calcio, y/o en ausencia de una glucoamilasa.

ANTECEDENTES

Los almidones vegetales, de cereales y granos, por ejemplo, almidón de maíz, se utilizan en gran medida en la fabricación industrial de productos tal como jarabes y biocombustibles. Por ejemplo, el jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (HFCS por sus siglas en inglés) es una forma procesada de jarabe de maíz con un alto contenido de fructosa y una dulzura comparable al azúcar, lo que hace que el HFCS sea útil como sustituto del azúcar en refrescos y otros alimentos procesados. La producción de HFCS representa actualmente una industria que mueve miles de millones de dólares. La producción de etanol como biocombustible es también una industria creciente [0003] Los jarabes y biocombustibles pueden producirse a partir de almidón mediante un proceso enzimático que cataliza la descomposición de almidón en glucosa. Este proceso enzimático implica normalmente una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas:

(1) Licuefacción: Las alfa (a) -am ilasas (EC 3.2.1.1) cata lizan primero la degradación de una suspensión de almidón, que puede contener un 30-40 % plp sólidos secos (ds) a maltodextranos. Las a-amilasas son endohidrolasas que catalizan la escisión aleatoria de enlaces intemos a-1 , 4-D-glucosídicos. Puesto que la licuefacción se realiza normalmente con temperaturas altas, p. ej., 90-100 oC, se prefieren para esta etapa las a-amilasas termoestables, tal como una a-am ilasa de Bacillus sp. Las a-amilasas utilizadas actualmente para esta etapa, p. ej., a-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus (AmyS) , no producen cantidades significativas de glucosa. En su lugar, el producto licuado resultante presenta un equivalente bajo en dextrosa (DE) y contiene maltosa y azúcares con alto grado de polimerización (OPn) .

(2) Sacarificación: Las glucoamilasas y/o a-amilasas maltogénicas cata lizan la hidrólisis de extremos no

reductores de los maltodextranos formados tras la licuefacción, liberando O-glucosa, maltosa e isomaltosa. La sacarificación produce jarabes con alto contenido de glucosa o bien con alto contenido de maltosa. En el último caso, las glucoamilasas catalizan normalmente la sacarificación bajo condiciones ácidas con temperaturas elevadas, p. ej., 60 oC, pH 4, 3. Las glucoamilasas utilizadas en este proceso se obtienen normalmente de hongos, p. ej., glucoamilasa de Aspergillus nigger utilizada en OPTIDEX® L400 o glucoamilasa de Humicula grisea. Las enzimas desramificantes, tal como pululanasas, pueden ayudar a la saca rificación.

Las a-amilasas maltogénicas pueden catalizar de forma altemativa la sacarificación para formar jarabes con alto contenido de maltosa. Las a-amilasas maltogénicas presentan normalmente un pH óptimo superior y

una temperatura óptima inferior a la glucoamilasa y las amilasas maltogénicas requieren normalmente Ca 2 + Las a-amilasas maltogénicas utilizadas actualmente para esta aplicación incluyen a-amilasas de B.subtilis , amilasas vegetales y la Q-amilasa de Aspergillus oyzae, el ingrediente activo de CLARASE® L A continuación, se representan las reacciones de sacarificación de ejemplo utilizadas para producir diferentes productos·

Almid (m Iicmtdo 0.3 % O-glucosa 2.0 % maltosa 97.7 % Olros oligosacáridos

-1') 1·1."i.."i

-pH 4.5

SacarificacilÍn a-ami lasa maltogénica pululan asa Glucoamilasa y/o ."iD pp tll Ca'~ -f¡ () ~c. 72 h _, , 0c. 48 h

Jarahc glucosa Jarahe maltosa >95 % D-glucosa 4 % O-glucosa 1.5 %mahosa .:'\6 % maltosa

0.5 %isomaltosa 28 % maltolriosa 65 J.O % Olros oligosacáridos 12 % Olros oligosacáridos (3) Procesamiento adicional: Un punto de ramificación en el proceso tiene lugar tras la producción de un jarabe rico en glucosa, mostrado en el lado izquierdo de las vías de reacción anteriores. Si el producto final deseado es un biocombustible, la levadura puede fermentar el jarabe rico en glucosa en etanol. Por otro lado, si el producto final deseado es un jarabe rico en fructosa , la isomerasa de glucosa puede catalizar la conversión del jarabe rico en glucosa a fructosa [0005] La sacarificación es la etapa limitadora de velocidad en la producción de un jarabe rico en glucosa. La sacarificación normalmente tiene lugar tras 48-72 horas, cuando muchas glucoamilasas fúngicas pierden actividad significativa. Además, aunque las a-ami lasas maltogénicas y las glucoamilasas puedan catalizar la sacarificación, las enzimas normalmente funcionan con temperaturas y pH óptimas diferentes, tal como se ha mostrado anteriormente. Si se utilizan ambas enzimas de forma secuencial, la diferencia en las condiciones de reacción entre las dos enzimas requiere el ajuste del pH y la temperatura, lo que ralentiza el proceso en general y puede dar lugar a la formación de agregados de amilosa insolubles.

Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de un proceso mejorado para la realización de productos industriales a partir de almidón En concreto, existe la necesidad de eficiencias mejoradas en una etapa de sacarificación.

SUMARIO

Se describen composiciones y métodos relacionados con una a-amilasa de Bacillus subtilis (AmyE) y polipéptidos relacionados. La a-amilasa de AmyE es única porque muestra una actividad específica alta por debajo del pH 5, 0 e incluso con aproximadamente pH 4-4, 5. Además, Ca2+ no afecta a la estabilidad térmica de AmyE, lo que evita la necesidad de añadir Ca2• exógeno a las reacciones de licuefacción o saca rificación de almidón. Estas características de polipéptidos AmyE permiten que la licuefacción y la sacarificación se lleven a cabo en la misma mezcla de reacción (y de fOfma opcional en el mismo recipiente de reacción) sin necesidad de regular el pH de la mezcla de reacción entre la licuefacción y la sacarificación. En concreto, las condiciones de reacción no han de regularse cuando se utiliza AmyE y una glucoamilasa, lo que evita una etapa y retrasos entre la licuefacción y la saca rificación, junto con la posible formación de agregados de amilosa insoluble. Por lo tanto, se puede utilizar AmyE de forma secuencial o simultánea con una glucoamilasa para licuar y/o sacarificar almidón, y con un pH y una concentración Ca2• que sean óptimos para la glucoamilasa. AmyE también muestra actividad de glucoamilasa, lo que reduce o elimina la necesidad de un polipéptido adicional con actividad de glucoamilasa con el fin de llevar a cabo la sacarificación.

La invención proporciona un método para producir etanol a partir de un sustrato de almidón, que comprende: la licuefacción y sacarificación de un sustrato de almidón con el fin de producir glucosa mediante la puesta en contacto de dicho sustrato de almidón con un polipéptido AmyE con la secuencia de SEO ID NO: 1, SEO ID NO" 2 o SEO ID NO: 3, en el que la licuefacción y la sacarificación se llevan a cabo en la misma mezcla de reacción sin un ajuste de pH; comprendiendo dicho método la fermentación de dicha glucosa con el fin de producir etanol

En algunas formas de realizaciórJ, la sacarificación se lleva a cabo en ausencia de un polipéptido adicional

con actividad de glucoamilasa. En algunas formas de realización, la licuefacciórJ se lleva a cabo con un pH

adecuado para la actividad de un polipéptido de glucoamilasa. En algunas formas de realizaciórJ, el pH es 5, 0 o 45 inferior. En algunas formas de realización, el pH es 4, 5 o inferior. En formas de realización específicas, el pH es 4, 0 o inferior. En algunas formas de realización, el calcio exógeno no se añade a la mezcla de reacción. En algunas formas de realización, la concentración de calcio en la mezcla de reacción es inferior a aproximadamente 8 ppm

En algunas formas de realización, se añade un polipéptido adicional con actividad de glucoamilasa a la mezcla de reacciórJ antes de que el sustrato de almidón entre en contacto con el polipéptido AmyE. En algunas formas de rea lización, el polipéptido adicional con actividad de glucoamilasa se añade a la mezcla de reacción tras la puesta en contacto del sustrato de almidón con el polipéptido AmyE. En algunas formas de realización, el polipéptido adicional con actividad de glucoamilasa se añade a la mezcla de reacción de forma simultánea con la... [Seguir leyendo]

1. Método para producir etanol a partir de un sustrato de almidón, que comprende: la licuefacción y sacarificación de un sustrato de almidón con el fin de producir glucosa mediante la puesta en contacto de dicho sustrato de almidón con un polipéptido AmyE con la secuencia de SEO ID NO: 1, SEO

ID NO: 2 o SEO ID NO: 3, en el que la licuefacción y la sacarificación se llevan a cabo en la misma mezcla de reacción sin un ajuste del pH; comprendiendo dicho método la fermentación de dicha glucosa con el fin de producir etanol

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos una parte de la sacarificación y la 10 fermentación tiene lugar en la misma mezcla de reacción de forma simultánea.

J. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el calcio exógeno no se añade a la mezcla de reacción.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la concentración de calcio en la mezcla de reacción es inferior a aproximadamente 8 ppm.