Procedimiento de aislamiento de células diana.

Procedimiento de enriquecimiento y / o aislamiento de las células diana en una muestra,

en el que la muestra comprende glóbulos rojos y / o plaquetas, que comprende:

(a) filtrar la muestra a través de un elemento de filtro que tiene poros con un tamaño de entre 0,5 y 5 μm,

(b) poner en contacto las células retenidas por el elemento de filtro en la etapa (a) con una superficie de separación, en el que dicha superficie de separación es un recubrimiento de hidrogel sobre un material soporte y comprende moléculas de afinidad que se unen selectivamente a la célula diana;

(c) incubar las células y la superficie de separación en condiciones que permitan la unión de las moléculas de afinidad a las células diana; y

(d) separar la superficie de separación de cualquier célula no unida y el material.

Procedimiento de aislamiento de células diana La presente invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento y / o aislamiento de células diana en una muestra, en la que la muestra comprende glóbulos rojos y / o plaquetas, comprendiendo dicho procedimiento (a) filtrar la muestra a través de un elemento de filtro que tiene un tamaño de poro o de malla entre 0, 5 y 5 µm, (b) poner en contacto las células retenidas por el elemento de filtro en la etapa (a) con una superficie de separación, en el que dicha superficie de separación está recubierta con un hidrogel y comprende moléculas de afinidad que se unen selectivamente a las células diana, (c) incubar las células y la superficie de separación en condiciones que permiten la unión de las moléculas de afinidad a las células diana; y (d) separar la superficie de separación de cualquier célula y material no unidos.

Antecedentes de la invención En estudios clínicos se ha demostrado que las células tumorales diseminadas (CTD) , es decir, las células tumorales que son detectables en sangre periférica o en la médula ósea de un paciente de cáncer, proporcionan valor informativo en términos de pronóstico de un paciente de cáncer, así como la evaluación del resultado terapéutico. Aparte de esto, estas células en muchos casos tienen la capacidad de indicar la existencia de un tumor en una fase temprana de la enfermedad.

Por ejemplo, los estudios con pacientes con cáncer de mama revelaron que la detección de células tumorales diseminadas en la sangre de los pacientes se correlacionaba significativamente con una supervivencia libre de progresión y una supervivencia global reducidas (Gaforio y col., (2003) Int. J. Cancer, 107 (6) :984-90; Statho-poulou y col., (2002) J. Clin. Oncol., 20 (16) :3404-12) . Se obtuvieron resultados similares a partir de estudios realizados en otros tipos de cáncer (Koch y col., (2005) Ann. Surg., 241 (2) :199-205; Kinele y col., (2003) Ann. Surg., 238 (3) :32430) . De acuerdo con lo anterior, la monitorización precisa de las células tumorales diseminadas que están presentes en la sangre o en la médula ósea de pacientes con cáncer proporciona parámetros útiles para la optimización de la terapia y para predecir la evolución de la enfermedad.

Además, la diseminación hematógena de las células tumorales de un tumor primario también se supone que desempeña un papel en el desarrollo de metástasis (Eccles S.A. y Welch D.R. (2007) , Lancet, 369, 1742-1757) . La formación de metástasis en lugar de la progresión del propio tumor primario es la principal causa de muerte en las enfermedades tumorales. Por lo tanto, la detección de los primeros signos de formación de metástasis es crucial para el régimen de tratamiento que debe aplicarse a un paciente de cáncer.

En la actualidad, la detección y el aislamiento de las células tumorales diseminadas se realiza rutinariamente mediante el uso de perlas magnéticas que comprenden anticuerpos que se unen a antígenos de superficie definidos de las células tumorales Estas perlas modificadas se incuban con una muestra de sangre de un individuo para unirse específicamente a las células tumorales que están presentes en la muestra. Sin embargo, las actuales técnicas disponibles se asocian con un alto grado de adhesión celular no específica a las perlas, así como una baja tasa de detección de células tumorales. Se sabe que, debido al elevado número de células no diana, en particular glóbulos rojos, en la muestra, no se puede garantizar en los procedimientos utilizados rutinariamente que cada célula tumoral en una muestra puede interaccionar con la superficie presentadora al anticuerpo de una perla para un tiempo suficientemente largo de manera que se produce la unión entre el anticuerpo inmovilizado y la célula diana. Por el contrario, un número significativo de células tumorales en una muestra no entrará en contacto con sus moléculas de captura correspondientes.

Por esta razón, en la técnica anterior se hicieron intentos para eliminar los glóbulos rojos con el fin de enriquecer las células tumorales en la muestra. Por ejemplo, se usó una centrifugación en gradiente de densidad utilizando medios de gradiente de densidad específicos (tales como Ficoll, Nycodens, Nycoprep, y similares) . Los medios empleados para este propósito tienen densidades comprendidas entre la densidad de los glóbulos rojos y las células nucleadas. Tras la centrifugación, os glóbulos rojos y las células nucleadas sanguíneas se enriquecen en diferentes fases de los medios y se pueden separar uno de otro mediante pipeteado. Este enfoque tiene la desventaja particular de que es laborioso y requiere personal altamente experimentado para realizar la separación. Además, las células tumorales diseminadas pueden exhibir una gama amplia de densidad que significa que parte de estas células puede no estar disponible para la posterior etapa de unión por afinidad. El uso de medios de gradiente de densidad también requiere varias etapas de lavado de las células tumorales que se asocian con varios efectos adversos, tales como la tensión de cizallamiento y la adsorción no específica de las células a la pared de los tubos de reacción, los cuales pueden tener como resultado una pérdida de células diana. Se ha demostrado que el enriquecimiento de células tumorales mediante centrifugación en gradiente de densidad da como resultado regularmente una pérdida de casi dos tercios de las células tumorales presentes en la muestra (Choesmel y col., (2004) , 101, 693-703) . Adicionalmente, la centrifugación en gradiente de densidad no permite el procesamiento de grandes volúmenes de la muestra, lo que es una clara desventaja a la hora de considerar que las células tumorales diseminadas están presentes en la sangre o la médula ósea a concentraciones extremadamente bajas.

En un enfoque alternativo al que se utiliza actualmente, los glóbulos rojos se lisan mediante la adición a la muestra de sangre de tampón de lisis, tal como cloruro amónico. Mediante la adición de tampón de lisis, las membranas de los glóbulos rojos se rompen, lo que tiene como resultado la muerte celular y la liberación de los componentes intracelulares. Sin embargo, se ha demostrado que el uso de tampones de lisis regularmente también rompe una porción considerable de las células tumorales diseminadas presentes en la muestra. Adicionalmente, se puede suponer que el uso de estos tampones afectará negativamente el metabolismo de las células diana, lo que podría ser desventajoso para otras etapas de procesamiento (por ejemplo, el cultivo de las células aisladas) . El abordaje "Metacell" de Brandt y Gedig (2009) usa etapas de preselección e hidrogeles recubiertos.

A la luz de los problemas mencionados anteriormente, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento mejorado para enriquecer y / o aislar células diana que están presentes en una muestra biológica junto con glóbulos rojos y / o plaquetas, teniendo dicho procedimiento una alta tasa de recuperación y, al mismo tiempo implica un tratamiento suave de las células diana de modo que solo unas pocas células diana se rompen durante el proceso. En particular, el proceso no debe imponer una extensa tensión mecánica o química sobre las células diana. También es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento que permite una unión altamente específica de las células diana en las muestras de sangre a las superficies de separación, procedimiento que se caracteriza por una adhesión no específica reducida de las células no diana, tales como glóbulos rojos, a dichas superficies. Estos objetos y otras ventajas se consiguen mediante los procedimientos definidos en las reivindicaciones adjuntas.

En la presente invención se ha encontrado que un procedimiento combinado que comprende la filtración de una muestra que contiene glóbulos rojos y / o plaquetas (tales como una muestra de sangre entera) a través de un elemento de filtro que tiene un tamaño de poro particularmente pequeño y la posterior separación de las células diana en la fracción retenida a través de superficies de separación a la que las células diana se unen específicamente, tiene como resultado una tasa de recuperación extremadamente alta. En los ejemplos de la presente invención, se pudo recuperar casi el 100 % de las células diana marcadas sometidas al procedimiento de la invención. La adhesión no específica de los glóbulos rojos, las plaquetas o los leucocitos a las superficies de separación, lo que podría interferir con la etapa de unión por afinidad, se reduce considerablemente mediante la etapa inicial de filtración. Asimismo, se ha encontrado que los leucocitos que se han separado mediante la etapa de filtrado... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de enriquecimiento y / o aislamiento de las células diana en una muestra, en el que la muestra comprende glóbulos rojos y / o plaquetas, que comprende:

(a) filtrar la muestra a través de un elemento de filtro que tiene poros con un tamaño de entre 0, 5 y 5 µm,

(b) poner en contacto las células retenidas por el elemento de filtro en la etapa (a) con una superficie de separación, en el que dicha superficie de separación es un recubrimiento de hidrogel sobre un material soporte y comprende moléculas de afinidad que se unen selectivamente a la célula diana;

(c) incubar las células y la superficie de separación en condiciones que permitan la unión de las moléculas de afinidad a las células diana; y

(d) separar la superficie de separación de cualquier célula no unida y el material.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tamaño de poro del elemento de filtro está entre 1 y 2 µm.

3. Procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el elemento de filtro es una tela tejida.

4. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las células diana son células tumorales.

5. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la muestra comprende sangre entera, orina, derrame pleural, ascitis, lavado broncoalveolar, aspirado de pezón de la glándula mamaria femenina o médula ósea.

6. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el material de soporte es un portaobjetos, una perla o una resina de cromatografía.

7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la molécula de afinidad es un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un ligando, una lectina o un receptor o un aptámero.

8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el que la molécula de afinidad es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-EpCAM, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-CD19, un anticuerpo anti-CK20, un anticuerpo anti-MUC1, un anticuerpo anti-MUC2, o un fragmento de unión al antígeno.

9. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la muestra se diluye con un tampón adecuado antes o simultáneamente con la aplicación de la muestra al elemento de filtro.

10. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la incubación en la etapa (c) incluye la agitación de la superficie de separación.

11. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la etapa (d) incluye el lavado de la superficie de separación con un tampón de lavado.

12. Procedimiento de detección y/o cuantificación de las células diana en una muestra, en el que la muestra comprende glóbulos rojos y / o plaquetas, comprendiendo dicho procedimiento

(a) realizar un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y b) detectar y / o cuantificar las células diana.

13. Procedimiento de la reivindicación 12, en el que la detección y / o cuantificación se realiza mediante el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos marcados de manera detectable o mediante sondas de ADN marcadas de forma detectable.

14. Procedimiento de la reivindicación 12, en el que la detección y / o cuantificación implica una PCR, preferentemente una PCR en tiempo real.

15. Procedimiento de la reivindicación 12, en el que la detección de implica técnicas fotoacústicas de dos colores.