Variantes de glucoamilasa.

Una variante de glucoamilasa aislada que comprende un dominio catalítico y un dominio de unión a almidón (SBD por sus siglas en inglés),



(a) comprendiendo dicho dominio catalítico al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos**Tabla**

y

(b) comprendiendo dicho SBD la sustitución de aminoácidos N563I, N563C, N563E, N563A, N563K, N563L, N563Q, N563T o N563V en la secuencia de aminoácidos:**Tabla**

o

en una posición equivalente en un SBD de glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia; presentando dicha variante de glucoamilasa una termoestabilidad aumentada comparada con dicha glucoamilasa precursora, en la que la termoestabilidad se mide como el % de actividad residual tras la incubación durante 1 hora a 64 grados centígrados en un tampón de NaAc pH 4,5.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12157549.

Solicitante: DANISCO US INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 925 PAGE MILL ROAD PALO ALTO, CA 94304 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: AEHLE, WOLFGANG, BOTT, RICHARD, R., NIKOLAEV,IGOR, SCHEFFERS,Martijn, VAN SOLINGEN,PIET, VROEMEN,CASPER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/56 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
  • C12N9/34 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Glucoamilasa.

PDF original: ES-2502743_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Variantes de glucoamilasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a variantes de glucoamilasa. En concreto, la invención hace referencia a variantes en el dominio de unión a almidón (SBD por sus siglas en inglés) de una glucoamilasa. La invención también hace referencia a variantes que presentan propiedades alteradas (p. ej., termoestabilidad mejorada y/o actividad específica aumentada) comparadas con una glucoamilasa precursora correspondiente. La presente invención también proporciona composiciones de enzima que comprenden glucoamilasas variantes; construcciones de ADN que comprenden polinucleótidos que codifican las variantes y métodos para producir las variantes de glucoamilasa en células huésped.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las enzimas de glucoamilasa (glucano 1, 4-α-glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) son carbohidrasas hidrolizantes de almidón que actúan en exo, que catalizan la eliminación de unidades de glucosa sucesivas de los extremos no reductores de moléculas relacionadas con oligosacáridos o polisacáridos o almidón. Las glucoamilasas pueden hidrolizar tanto los enlaces glucosídicos lineales como ramificados de almidón (p.ej., amilosa y amilopectina) .

Las glucoamilasas se producen mediante numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Especialmente interesante, y comercialmente importante, las glucoamilasas son enzimas fúngicas que se producen de forma extracelular, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun. 48:529 -544; Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 -1102; Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. Chem. 53:923 -929; patente estadounidense 5.024.941; patente estadounidense 4.794.175 y WO 88/09795) ; Talaromyces (patente estadounidense 4.247.637; patente estadounidense 6.255.084 y patente estadounidense 6.620.924) ; Rhizopus (Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957 -964; Ashikari et al., (1989) App. Microbiol. and Biotech. 32:129 -133 y patente estadounidense 4.863.864) ; Humicola (WO 05/052148 y patente estadounidense 4.618.579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:210 -217) . Muchos de los genes que codifican estas enzimas han sido clonados y expresados en células bacterianas, fúngicas y/o levadura.

Comercialmente, las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (p. ej., para la producción de glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón) . Las glucoamilasas se utilizan para producir edulcorantes de maíz con alto contenido de fructosa, que comprenden más del 50 % del mercado de edulcorantes en Estados Unidos. En general, las glucoamilasas pueden utilizarse, y normalmente se utilizan, con alfa-amilasas en procesos hidrolizantes de almidón para hidrolizar almidón en dextrinas y posteriormente glucosa. La glucosa puede entonces convertirse en fructosa por parte de otras enzimas (p. ej., isomerasas de glucosa) ; cristalizada; o utilizada en fermentaciones con el fin de producir numerosos productos finales (p. ej., etanol, ácido cítrico, ácido láctico, succinato, intermediarios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerol y 1, 3-propanediol) . El etanol producido mediante el uso de glucoamilasas en la fermentación de almidón y/o material que contiene celulosa puede utilizarse como una fuente de combustible o para consumo alcohólico.

Aunque las glucoamilasas se han utilizado con éxito en aplicaciones comerciales durante muchos años, todavía existe la necesidad de nuevas glucoamilasas con propiedades modificadas, tal como actividad específica mejorada y termoestabilidad aumentada.

WO 2003/029449 expone variantes de la glucoamilasa Aspergillus niger G1 que presenta termoestabilidad y/o actividad específica modificada. WO 2007/057018 expone las variantes de glucoamilasa Talaromyces and Aspergillus. WO 2006/060062 expone secuencias para la glucoamilasa Trichoderma reesei y para usarse en la conversión de almidón, pienso animal y fermentación alcohólica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la presente invención proporciona variantes de glucoamilasa que comprenden un dominio catalítico y un dominio de unión a almidón (SBD) . El dominio catalítico comprende al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos y el SBD comprende la sustitución de aminoácidos N563I, N563C, N563E, N563A, N563K, N563L, N563Q, N563T o N563V en la secuencia de aminoácidos o una posición equivalente en un SBD de glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia. Las variantes de glucoamilasa de la invención muestran termoestabilidad aumentada (medida como el % de actividad residual tras la incubación durante 1 hora a 64 grados centígrados en tampón NaAc pH 4, 5) y/o actividad específica aumentada comparada con la glucoamilasa precursora.

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa presentan un dominio catalítico con al

menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora comprende un SBD que presenta al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un SBD elegido de:

En algunas formas de realización, las variantes de glucoamilasa comprenden además una o más sustituciones en las posiciones correspondientes a la posición 493, 494, 495, 501, 502, 503, 508, 511, 517, 518, 519, 520, 525, 527, 531, 533, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 545, 546, 547, 549, 551, 561, 567, 569, 577, 579 o 583 de SEQ ID NO:2 o en una posición equivalente en la glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia;

En algunas formas de realización, la variante de glucoamilasa de la reivindicación comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición correspondiente a una posición de residuo: 10, 14, 15, 23, 42, 45,

46. 59, 60, 61, 67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152,

153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263, 264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408. 410, 415, 417, 418, 430, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3.

En algunas formas de realización, la glucoamilasa precursora se obtiene de una Trichoderma spp.

La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican las variantes de glucoamilasa como se define en la reivindicación 1 y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos.

También se proporcionan composiciones de enzima que comprenden variantes de glucoamilasa según se definen en la reivindicación 1, en la que la composición es adecuada para utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una fórmula de pienso animal o un proceso de fermentación alcohólica que contiene almidón. En algunas formas de realización, la composición adecuada para utilizarse en un proceso de conversión de almidón comprende además un alfa-amilasa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una glucoamilasa variante en una célula huésped, que comprende la transformación de una célula huésped con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido que codifica una variante de glucoamilasa según se define en la reivindicación 1; el cultivo de la célula huésped en las condiciones adecuadas para la expresión y producción de la variante de glucoamilasa y la producción de la variante.

En algunas formas de realización, el método comprende además la recuperación de la glucoamilasa del cultivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0016]

La fig. 1A ilustra una glucoamilasa Trichoderma reesei (TrGA) que presenta 632 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) El péptido señal se subraya, la región catalítica (SEQ ID NO:3) que comienza con los residuos de aminoácidos SVDDFI (SEQ ID NO:12) y que presenta 453 residuos de aminoácidos está en negrita; la región de enlace está en cursiva y el dominio de unión a almidón (SBD) es tanto en cursiva como subrayado. La proteína madura que incluye el dominio catalítico (SEQ ID NO:3) , la región de enlace (SEQ ID NO:10) y el dominio de unión a almidón (SEQ ID NO:11) se representan mediante SEQ ID NO:2. Con respecto a la numeración de SBD de la molécula de glucoamilasa TrGA, se hace referencia en la presente exposición tanto a) las posiciones 491 a 599 en SEQ ID NO:2 de la TrGA madura y/o posiciones 1 a 9 en SEQ ID NO:11 que representa la secuencia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una variante de glucoamilasa aislada que comprende un dominio catalítico y un dominio de unión a almidón (SBD por sus siglas en inglés) ,

(a) comprendiendo dicho dominio catalítico al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos y

(b) comprendiendo dicho SBD la sustitución de aminoácidos N563I, N563C, N563E, N563A, N563K, N563L, N563Q, N563T o N563V en la secuencia de aminoácidos:

o en una posición equivalente en un SBD de glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia;

presentando dicha variante de glucoamilasa una termoestabilidad aumentada comparada con dicha glucoamilasa precursora, en la que la termoestabilidad se mide como el % de actividad residual tras la incubación durante 1 hora a 64 grados centígrados en un tampón de NaAc pH 4, 5.

2. Variante de glucoamilasa aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el dominio catalítico presenta al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

3. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa precursora comprende un SBD que presenta al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un SBD elegido de entre:

o 4. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una o más sustituciones en una posición correspondiente a la posición 493, 494, 495, 501, 502, 503, 508, 511, 517, 518, 519, 520, 525, 527, 531, 533, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 545, 546, 547, 549, 551, 561, 567, 569, 577, 579 o 583 de SEQ ID NO:2 o en una posición equivalente en dicha glucoamilasa precursora como se determina mediante la alineación de secuencia.

5. Variante de glucoamilasa aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una o más sustituciones de aminoácidos en una posición correspondiente a la posición de residuo: 10, 14, 15, 23, 42, 45, 46, 59, 60, 61, 67, 68, 72, 73, 97, 98, 99, 102, 108, 110, 113, 114, 122, 124, 125, 133, 140, 144, 145, 147, 152, 153, 164, 175, 182, 204, 205, 214, 216, 219, 228, 229, 230, 231, 236, 239, 240, 241, 242, 244, 263,

264, 265, 268, 269, 276, 284, 291, 300, 301, 303, 310, 311, 313, 316, 338, 342, 344, 346, 349, 359, 361, 364, 379, 382, 390, 391, 393, 394, 408, 410, 415, 417, 418, 430, 431, 433, 436, 442, 443, 444, 448 y 451 de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3.

6. Variante de glucoamilasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa precursora se obtiene a partir de una Trichoderma spp.

7. Un polinucleótido que codifica la variante de acuerdo con la reivindicación 1.

8. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una composición de enzima que comprende la variante de glucoamilasa según la reivindicación 1, en la que la composición es adecuada para utilizarse en un proceso de conversión de almidón, una formulación

de pienso animal o un proceso de fermentación alcohólica.

10. Una composición de enzima adecuada para utilizarse en un proceso de conversión de almidón de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende además un alfa-amilasa.

11. Un método para producir una variante de glucoamilasa en una célula huésped que comprende la transformación de una célula huésped con una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 7; el cultivo de la célula huésped en las condiciones adecuadas para la expresión y producción de dicha variante de glucoamilasa y la producción de dicha variante.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además la recuperación de la variante de glucoamilasa de dicho cultivo.


 

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