Variantes de alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (AMYS) con propiedades mejoradas.

Una variante de polipéptido que tiene actividad de α-amilasa en la que la variante de polipéptido tiene al menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima,

comprendiendo la variante de polipéptido:

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido de α-amilasa parental seleccionado de entre AmyS que tienen la secuencia de SEQ ID Nº: 1 o una variante truncada de AmyS que tiene la secuencia de SEQ ID Nº 2, y

que tiene al menos la siguiente mutación en un residuo de aminoácido correspondiente al del polipéptido de α-amilasa parental como se determina alineando las variantes de polipéptidos con el polipéptido parental, donde la mutación cambia el residuo de aminoácido a partir del de los polipéptidos parentales, y

donde la mutación es una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 188P y 188D.

Variantes de alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (AMYS) con propiedades mejoradas CAMPO TÉCNICO

Se describen variantes de una α-amilasa original que muestra una alteración en al menos una de las siguientes propiedades en relación con dicha α-amilasa original: actividad específica, especificidad de sustrato, 5 unión de sustrato, escisión de sustrato, estabilidad térmica, actividad dependiente de pH, estabilidad dependiente de pH, estabilidad a la oxidación, dependencia de Ca2+, pI y rendimiento de lavado. Las variantes son adecuadas para la conversión de almidón, la producción de etanol, el lavado de ropa, el lavado de vajillas, la limpieza de superficies duras, el desaprestado de textiles y/o la producción de edulcorante.

ANTECEDENTES 10

Las alfa (α) -amilasas (α-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados. Las α-amilasas se pueden utilizar comercialmente en las etapas iniciales del procesamiento de almidón (licuefacción) ; en la molienda de maíz húmedo; en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices detergentes; en la industria textil para el desaprestado del almidón; en aplicaciones de horneo; en la industria de 15 las bebidas; en campos petrolíferos en los procesos de perforación; en el destintado de papel reciclado y en piensos para animales.

WO02/092797 describe variantes (mutantes) de alfa-amilasas originales tipo Termamyl, cuya variante tiene actividad de alfa-amilasa y presenta propiedades alteradas en relación con el alfa-amilasa original.

Aunque se han utilizado α-amilasas actualmente disponibles con cierto éxito en estas aplicaciones, siguen 20 siendo necesarias α-amilasas con actividad específica aumentada, especificidad de sustrato adaptada, estabilidad térmica, de pH y a la oxidación mejorada, y dependencia de Ca2+ reducida.

En un aspecto, se describen las nuevas variantes (mutantes) α-amilolíticas de una α-amilasa SPEZYME® Xtra o de una α-amilasa tipo AmyS, en concreto, las variantes que presentan propiedades alteradas que son 25 ventajosas con respecto al procesamiento industrial del almidón (licuefacción, sacarificación y limpieza del almidón y similares) .

Dichas alteraciones en las propiedades se pueden conseguir introduciendo mutaciones en una α-amilasa parental que afectan, por ejemplo, a la actividad específica, a la especificidad de sustrato, a la unión de sustrato, al modelo de escisión de sustrato, a la estabilidad térmica, al perfil de actividad/pH, al perfil de estabilidad/pH, a 30 la estabilidad hacia la oxidación, a la dependencia de Ca2+ y a otras propiedades de interés. Por ejemplo, la alteración puede dar como resultado una variante que, en comparación con la α-amilasa original tipo Spezyme Xtra, tiene una dependencia de Ca2+ reducida y/o un perfil de actividad/pH y/o termoestabilidad alterados.

En algunos aspectos, las variantes se basan en la α-amilasa de Geobacillus stearothermophilus original, o tienen un grado específico de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a esta α-amilasa, por 35 ejemplo: 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 %. En otros aspectos, las variantes se basan en la α-amilasa original relacionada, por ejemplo, las que tienen al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la α-amilasa de Geobacillus stearothermophilus. 40

En algunos aspectos, se proporciona una variante de polipéptido que tiene actividad de α-amilasa y al menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima, comprendiendo la variante de polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido de α-amilasa parental seleccionado de entre AmyS (SEQ ID Nº 1) o una variante truncada de AmyS (SEQ ID Nº 2) , y que tiene al menos una de las siguientes mutaciones en un residuo de 45 aminoácidos correspondiente al del polipéptido de α-amilasa parental como se determina alineando las variantes de polipéptidos con el polipéptido parental, donde la mutación cambia el residuo de aminoácidos a partir del de los polipéptidos parentales:

a) una sustitución que introduce un residuo de aminoácidos cargado positivamente en una o varias posiciones seleccionado del grupo consistente en D19, N28, E29, Q86, Q89, Q97, N224, N271, N281, 50 D306, D318, Q319, Q358, D393, Q443, y D458;

b) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 74A, 115L, 124K, 124R, 132A, 132C, 135A, 145A, 146A, 148A, 148N, 159A, 159C, 159D, 159E, 159F, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 169A, 169L, 169M, 169Y, 179A, 181A, 181C, 181D, 181E, 181L, 181P, 181Q, 181V, 181Y, 242A, 242D, 242E, 242Q, 261L, 271A, 55

271V, 278A, 278H, 278K, 278N, 278R, 281A, 281L, 281M, 302D, 302M, 304D, 304E, 304M, 321A, 321H, 321Q, 321R, 333Q, 378D, 378N, 378R, 382D, 398A, 418A, 418M, 418N, 420A, 421R, 432A, 432D, 432L, 432M, 432N, 432Q, 432R, 432Y, 437D, 437G, 437H, 437L, 437M, 437Y, 446A, 446Y, 454A, 464Q, 464Y, 474A, 474E, 474K, 474L, 474M, 474N, 474P, 474Q, 474R, 474S, y 474V;

c) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo 5 consistente en 61, 6N, 6Q, 6T, 6V, 14T, 16F, 25A, 25C, 25G, 25Q, 27M, 36Q, 36S, 39G, 39V, 50I, 50L, 50M, 50N, 50Q, 52S, 53T, 67N, 67S, 80D, 80I, 90E, 133P, 133V, 137M, 137S, 141E, 141I, 141L, 141M, 141Q, 141R, 141S, 141V, 150E, 151I, 152G, 155S, 155Y, 168W, 173T, 188P, 193F, 193K, 193L, 193Y, 213L, 213M, 213V, 217Q, 220P, 220Q, 220R, 220S, 220V, 221I, 221S, 249E, 250F, 250I, 250M, 252L, 253Y, 254E, 254F, 254T, 254V, 255F, 255K, 255W, 257L, 257M, 257S, 257V, 258D, 258G, 258H, 258K, 10 258Q, 258T, 258V, 268F, 274W, 283M, 283N, 283V, 285E, 285Q, 293G, 293K, 294W, 301F, 301I, 301P, 301R, 301T, 301W, 309D, 309V, 312H, 312S, 312V, 312Y, 313G, 313H, 313I, 313L, 313S, 313V, 318T, 338A, 338C, 338G, 338M, 338T, 339K, 339T, 339V, 340A, 340M, 340Q, 340T, 343C, 343I, 343P, 343R, 343Y, 345I, 345Q, 369I, 369T, 370G, 375T, 385T, 386K, 394L, 394V, 400A, 400N, 400V, 402H, 402I, 402T, 402V, 402W, 403A, 403E, 403G, 403Q, 403R, 403T, 403V, 404C, 404E, 404G, 404I, 404V, 15 419A, 419C, 419M, 419T, 422E, 422G, 433A, 433H, 433I, 433K, 433L, 433M, 433V, 433Y, 442A, 442G, 442N, 442R, 442S, 442T, 442V, 442W, 442Y, 445G, 4451, 445N, 445T, 445V, 445W, 447I, 447N, 447Q, 447W, 447Y, 448C, 448F, 448G, 448H, 448I, 448N, 448Y, 450C, 450H, 450M, 450N, 450R, 450S, 450T, 450W, 455G, 455I, 455P, 455V, 463A, 463M, 463S, 463T, 463V, 463W, 465G, 465I, 465K, 465N, 465T, 465V, 469D, 469W, 469Y, 471I, 471V, 473G, 473Y, 476A, 476G, 476L, 476M, 476N, y 476T 20

d) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 124N, 125A, 125K, 125N, 130A, 130S, 159A, 159D, 159E, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 166F, 166G, 166H, 166S, 166Y, 169L, 179A, 179P, 180A, 180D, 180H, 180K, 180L, 180N, 180T, 180V, 180Y, 181A, 181D, 181E, 181G, 181P, 181R, 181S, 181V, 187A, 187C, 187K, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 242H, 242N, 278H, 278K, 278N, 278R, 281M, 302D, 304M, 304Y, 25 321H, 321Q, 321R, 333Q, 432Q, 437Y, 446A, 474Q, y 474S,

e) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 6A, 6D, 6E, 6H, 61, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 6Y, 13K, 14F, 14T, 14Y, 15A, 15D, 15E, 015G, 15H, 15K, 15N, 15P, 15Q, 15R, 15S, 15T, 15W, 16A, 16E, 16G, 16H, 16K, 16N, 16P, 16Q, 16R, 16T, 25C, 39D, 39E, 39N, 39Q, 81Y, 121P, 139D, 139H, 139R, 139Y, 177A, 188D, 30 191H, 191K, 192A, 192D, 192G, 192N, 192P, 192Q, 192S, 192T, 192V, 192Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196P, 196R, 196S, 196T, 196V, 201A, 201E, 201G, 201H, 201M, 202H, 216E, 216G, 216H, 216M, 216Q, 216R, 216S, 216T, 216Y, 221A, 221D, 221F, 221I, 221L, 221M, 221N, 221R, 221S, 221V, 221Y, 237G, 240G, 240N, 240P, 240Q, 240R, 240T, 246R, 250A, 250D, 250E, 250F, 250G, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250S, 250W, 252K, 268A, 268D, 268E, 268G, 268H, 35 268K, 268N, 268P, 268Q, 268R, 268S, 274A, 274D, 274G, 274I, 274K, 274L, 274N, 274Q, 274R, 274S, 274T, 275K, 285Q, 285Y, 293K, 293R, 318A, 318F, 318G, 318I, 318K, 318L, 318M, 318R, 318S, 318T, 318V, 318Y, 319C, 319D, 319H, 319I, 319K, 319R, 319Y, 320K, 320R, 320T, 338A, 338G, 338I, 338M, 338P, 338S, 338V, 339G, 339P, 340A, 340D, 340E, 340H,... [Seguir leyendo]

1. Una variante de polipéptido que tiene actividad de α-amilasa en la que la variante de polipéptido tiene al menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima, comprendiendo la variante de polipéptido:

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con 5 respecto a un polipéptido de α-amilasa parental seleccionado de entre AmyS que tienen la secuencia de SEQ ID Nº : 1 o una variante truncada de AmyS que tiene la secuencia de SEQ ID Nº 2, y

que tiene al menos la siguiente mutación en un residuo de aminoácido correspondiente al del polipéptido de α-amilasa parental como se determina alineando las variantes de polipéptidos con el polipéptido parental, donde la mutación cambia el residuo de aminoácido a partir del de los polipéptidos parentales, 10 y

donde la mutación es una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 188P y 188D.

2. Variante según la reivindicación 1, en la que la sustitución es 188P y la variante ha mejorado la termoestabilidad en comparación con el polipéptido parental. 15

3. Variante según la reivindicación 1, en la que la sustitución es 188D y la variante presenta actividad o expresión aumentada en comparación con el polipéptido parental.

4. Variante según la reivindicación 1, en la que la sustitución es E188P y la variante presenta reducción aumentada de la viscosidad en un ensayo de licuefacción de almidón en comparación con el polipéptido parental.

5. Variante según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en la que la mutación está presente en 20 combinación con glutamina en la posición 242, o en la que la mutación está presente en combinación con una deleción en las posiciones 179 y 180.

6. Variante según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en la que el polipéptido parental incluye un truncamiento de los 29 residuos de aminoácidos en la posición C-terminal.

7. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en la que la sustitución es E188P. 25

8. Composición de limpieza que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

9. Composición de licuefacción de almidón que comprende los polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

10. Método para hidrolizar un sustrato de almidón soluble utilizando una variante de α-amilasa, que comprende la puesta en contacto del sustrato de almidón con una variante de α-amilasa según cualquiera de las 30 reivindicaciones de la 1 a la 7.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en I181A, I181P, I181C, I181E, I181Y, S242A, S242E, S242Q, G132A, y N193Y.

12. Método según la reivindicación 10 u 11, que comprende además la puesta en contacto del sustrato de 35 almidón con una fitasa antes de la puesta en contacto con la variante de α-amilasa o de forma simultánea.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 12, en el que el sustrato de almidón hidrolizado se fermenta en etanol.

14. Método para la producción de edulcorante, comprendiendo el método la puesta en contacto de un sustrato de almidón con una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7. 40

15. Utilización de una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 en:

(i) el desaprestado de textiles, tejidos y prendas; o (ii) en la producción de pulpa de celulosa y papel.

Dibujos

Figura 1

Figura 1 (cont.)

Figura 1 (cont.)

Figura 1 (cont.)

Figura 3

% de actividad residual media de S242

alfa amilasa madura

Figura 2

Figura 4A

Figura 4B

Figura 4C

Figura 4D

Figura 4E

Figura 4F

Figura 4G

Figura 4H

Figura 4I

S242Q p/Ca2+

S242A p/Ca2+

Xtra p/Ca2+

Temperatura (º C)

Temperatura (º C)

Figura 6

Figura 5

Perfil de actividad (15 % almidón.

7. 85C ramp)

% Relativo a S242Q

% Relativo a Liq SC

Perfil de actividad (15 % almidón.

7. 85C ramp)

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

t en s

M en μNm

Tiempo (Minutos post-jet)

Progresión de DE 32 % suspensión de maíz molido entero vinaza como 30 % de diluyente pretratamient.

15. 185 º F, 10 min. chorro grande @ 225 º F 3 min. tiempo de retención secundario 185 º F durante 90 min.

Figura 11

Figura 12

Tiempo (Minutos post-jet)

Viscosidad 32 % suspensión de maíz molido entero vinaza como 30 % de diluyente pretratamient.

15. 185 º F, 10 min. chorro grande @ 225 º F 3 min. tiempo de retención secundario 185 º F durante 90 min.

Figura 13

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 14

Viscosidad (cP)

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 15

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Figura 16

Tiempo de incubación, min a 90C

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Viscosidad (cP)

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 17

Figura 18

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 19

Tiempo de incubación, min a 90C

Viscosidad (cP)

Proceso convencional - pH 5.8 (Licuado A)

Figura 20

DDGS, % ds

Sulfato

Sin fosfato

% IP 6

Ã?cido fítico

almidón

Producción de alcohol Galón/Bushel

1, 92 mg/gds

0, 23 mg/gds

1, 20

1, 33

0, 6

0, 2

9, 28

7, 25

2, 69

2, 70

Sin proceso de ajuste de pH, pH 5.2 3+1 AAU (dosis fraccionada) , 4 FTU BP-17, con jet cooking, 225 º F (Licuado B)

Condiciones de licuefacción

índice de progresión de DE a 90C

Figura 21

% de reducción de ácido fítico como IP6

índice de progresión de DE a 90C

% de reducción de ácido fítico como IP6

Tiempo de incubación, min a 85 C

Figura 22

Cambio de carga

Figura 23

Original

Variantes

blanco

Variantes

Original

blanco

Cambio de carga

Figura 24

Actividad específica relativa (almidón con BODIPY)

Original

Variantes

Cambio de carga

Figura 25

Figura 26

Actividad de hidrólisis de almidón con BODIPY específica relativa

Limpieza de micromuestra de almidón de maíz relativa

Expresión en tubo de agitación relativa

Expresión en tubo de agitación relativa

Original (AmyS-S242Q)

Variantes

Original

Figura 27

Actividad específica relativa (almidón con BODIPY)

Título de enzima relativa

Cambio de carga

Cambio de carga

Variantes

Título de enzima relativa

A488 - blanco

Variantes

Original

Cambio de carga

Cambio de carga

Figura 28

Actividad de fracción restante

Viscosidad final [μNm]

Figura 30

Cambio de carga

Carga neta en relación con AmyS natural

Figura 29

Actividad de micromuestra de almidón de arroz

pKa aparente

Cambio de carga

Figura 31

Cambio de carga

Figura 32

t en s

M en μNm

Viscosidad pico y final (torsión Nm)

Viscosidad pico o final (torsión Nm)

N193Y sola

dosis de N193Y (ug)

pico

pico

Reducción de la viscosidad de N193Y con BP111

fitasa (FTU) & AA (ug)

Figura 32 (cont.)