Vacuna para su uso en inmunoterapia tumoral.

Preparación de vacuna que comprende:

(i) células presentadoras de antígenos profesionales,

(ii) antígenos asociados con tumores, y

(iii) fantasmas bacterianos para su uso en inmunoterapia

Vacuna para su uso en inmunoterapia tumoral

La presente invención se refiere a una vacuna que comprende células presentadoras de antígenos profesionales, antígenos asociados a tumores y fantasmas bacterianos para su uso en inmunoterapia tumoral.

La terapia basada en células dendríticas usa células tumorales para estimular la inmunidad antitumoral. De este modo, las células dendríticas se incuban con células tumorales, en particular, con células tumorales autólogas (es decir, las propias células tumorales del paciente) para estimular la inmunidad antitumoral. Las células dendríticas incubadas con células tumorales extraen antígenos directamente de las células tumorales. Las células dendríticas que portan los antígenos asociados a tumores se usan a continuación como vacuna para estimular el sistema inmune contra el tumor. Mientras que las células dendríticas son necesarias para activar una respuesta contra el cáncer, son a menudo ineficaces sin incubación previa porque no reconocen cánceres en crecimiento como peligrosos. Mediante la activación de las células dendríticas, usando un estímulo externo, se crean células dendríticas que presentan los antígenos asociados al tumor relevantes y, por lo tanto, inducen una respuesta antitumoral efectiva.

Dicho enfoque se describe, por ejemplo, en el documento U.S. 2008/0031900. En este respecto, las células presentadoras de antígenos, tales como las células dendríticas, se activan con GM-CSF e ¡nterferón alfa en presencia de una o más células cancerosas.

Aunque se han hecho progresos considerables con dichas composiciones, aún se desea una mejora adicional.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición para su uso como se especifica en la reivindicación

1.

De acuerdo con la invención, se ha descubierto que la efectividad de células presentadoras de antígenos y, en particular, células dendríticas como vacunas antitumorales pueden mejorarse proporcionando una composición para su uso que contenga adicionalmente fantasmas bacterianos.

Los fantasmas bacterianos (FB) son envueltas celulares bacterianas vacías de bacterias, en particular, de bacterias gram-negativas. Las bacterias preferidas son E. coli o Shigella flexneri 2a y, en particular, E. coli Nissle 1917.

Los FB pueden producirse mediante la expresión controlada de genes heterólogos que causan la disrupción de la integridad de la membrana bacteriana y causando la lisis de la bacteria. Un ejemplo de gen lítico es el gen E de bacteriófago PhiX174 que codifica un polipéptido que activa la fusión de las membranas interna y externa de las células bacterianas y que forma un túnel transmembrana que se extiende por toda la envuelta celular, a través del cual todo el contenido citoplásmico se expulsa debido al cambio en la presión osmótica entre el interior celular y el medio de cultivo, mientras que las estructuras de las membranas interna y externa se conservan y permanecen intactas (consúltese el documento U.S. 7.968.323 B2). El tamaño de la estructura del túnel transmembrana depende de las condiciones de lisis y el diámetro interno está en el intervalo de 20-400 nm. El cuerpo vacío de los FB carece de ácidos nucleicos, ribosomas y otros constituyentes, mientras que las estructuras esenciales de la membrana interna y externa, incluyendo las moléculas antigénicas, por ejemplo, las proteínas de la membrana externa, adhesinas, LPS y peptidoglucanos no están desnaturalizados y permanecen intactos. No hay absolutamente ningún riesgo de que vuelvan a la forma patógena después de la inducción del proceso de lisis controlada.

Los fantasmas bacterianos pueden prepararse mediante un método que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar células bacterianas que comprenden un gen que codifica una proteína lítica capaz de formar una estructura de túnel en la envuelta celular bacteriana,

(b) cultivar opcionalmente las células bacterianas en condiciones en las que el gen lítico no se expresa,

(c) someter a la célula bacteriana a condiciones en las que el gen lítico se expresa y los componentes citoplásmicos de las células bacterianas se liberan y,

(d) obtener los fantasmas bacterianos resultantes.

Un ejemplo preferido de gen que codifica a la proteína lítica es el gen E de bacteriófago phiX174.

De manera particularmente preferida, las células bacterianas usadas para el método anteriormente descrito de preparación de fantasmas bacterianos codifican de manera adicional una enzima capaz de hidrolizar componentes citoplásmicos en la célula bacteriana, tal como se describe en el documento WO 03/006630. El método correspondiente de preparación de fantasmas bacterianos comprende las siguientes etapas adicionales:

(a) cultivar opcionalmente las células bacterianas en condiciones en las que el gen de la enzima no se expresa,

(b) someter a la célula bacteriana a condiciones en las que el gen de la enzima se expresa y los componentes

citoplásmicos de las células bacterianas se degradan.

El gen que codifica la enzima hidrolítica es preferentemente un gen de nucleasa, en particular, un gen de nucleasa de Staphylococcus aureus (documento WO 03/006630).

Los FB no muestran impactos citotóxicos o genotóxicos en la viabilidad y actividad metabólica en un amplio abanico de células probadas incluyendo macrófagos, células dendríticas, células tumorales, células endoteliales y células epiteliales. Los FB con sus estructuras superficiales intactas se reconocen de manera eficiente y se fagocitan por CPA profesionales, por ejemplo, células dendríticas y macrófagos mediante varios receptores de superficie, por ejemplo, receptores de complemento y receptores de tipo Toll. Además, los estudios adicionales que usaron CD como modelo de las células presentadoras de antígenos más profesionales (CPA profesionales) revelaron que su actividad fagocítica y captación de FB depende de la cepa bacteriana usada para la producción de FB.

Aunque el proceso de lisis es muy efectivo, todavía puede haber una contaminación potencial con aproximadamente una célula bacteriana intacta por cada 10.000 FB. Para evitar la presencia de cualquier célula viva en la preparación de FB, en particular, justo antes de la liofilización de las muestras de FB, se añade preferentemente un agente alquilante, tal como beta-propiolactona que reacciona y causa alteraciones en los ácidos nucleicos, al sistema de fermentación antes de la recolección final de FB. Se divulga un proceso de producción que usa beta-propiolactona para la inactivación final que cumple con los criterios para su aplicación en medicina humana y veterinaria se divulga en la Solicitud de Patente N° PCT/EP2009/000272.

El uso de fantasmas bacterianos como vacuna o adyuvantes y la preparación de fantasmas bacterianos recombinantes que portan proteínas heterólogas en sus estructuras de envuelta celular se divulgan en la Solicitud de Patente N° PCT/EP98/04723.

El uso de fantasmas bacterianos como transportador o vehículo de direccionamiento de compuestos activos se divulga en la Solicitud de Patente N° PCT/EP00/01906.

La composición para su uso de acuerdo con la invención comprende como componente (i) células presentadoras de antígenos profesionales. En una realización preferida, la composición para su uso comprende monocitos y, lo más preferentemente, células dendríticas (CD). En particular, la composición para su uso de la invención después de incubación y lista para su administración comprende células dendríticas presentadoras de antígenos tumorales maduras.

Las CD son las CPA profesionales más potentes, así como potentes iniciadoras y moduladoras de las respuestas de los linfocitos T in vivo incluyendo la sensibilización de linfocitos T restringidos a CMH, desarrollo de producción de anticuerpos dependientes de linfocitos T, e inducción de tolerancia inmunológica. Las CD tienen una alta actividad fagocítica tanto en tejido periférico como en tejidos linfoides secundarios, y capturan antígenos (Ag) mediante varios mecanismos, incluyendo macropinocitosis y endocitosis mediada por receptores. El papel principal de las CD está relacionado con el reconocimiento de señales de peligro potencial proporcionadas por antígenos externos, su internalización, procesamiento y presentación dentro de complejo de moléculas de clase I y II del CMH. En la mayoría de los casos en condiciones fisiológicas normales, las CD están presentes en su estado inmaduro caracterizado por alta capacidad fagocítica, baja expresión de moléculas coestimuladoras y de presentación de Ag, y baja producción de citocinas. La fagocitosis de antígenos solubles mediante receptores de... [Seguir leyendo]

1. Preparación de vacuna que comprende:

(i) células presentadoras de antígenos profesionales,

(¡I) antígenos asociados con tumores, y (iii) fantasmas bacterianos

para su uso en inmunoterapia.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde las células presentadoras de antígenos comprenden monocitos.

3. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las células presentadoras de antígenos comprenden células dendríticas.

4. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprenden uno

0 más lisados tumorales.

5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende fantasmas bacterianos obtenidos de células bacterianas que comprenden un gen que codifica una proteína lítica.

6. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende fantasmas bacterianos que se han tratado con (3-proplolactona.

7. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende fantasmas bacterianos de bacterias gram-negativas, en particular, de E. coli y, más preferentemente, de E. coli Nissle 1917.

8. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende fantasmas bacterianos cargados con un activador o silenciador del sistema ¡nmumtario, un agente farmacéutico y/o ADN.

9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende de 1 a 10.000, en particular, de 10 a 1.000 fantasmas bacterianos por célula presentadora de antígenos.

10. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende de

1 a 10 millones de células presentadoras de antígenos por dosis.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende células presentadoras de antígenos que inducen reconocimiento de antígenos tumorales y eliminación específica de tumor por linfocitos T.

12. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende células presentadoras de antígenos autólogas.