Uso de una preparación robusta de multi-enzimas, para la síntesis de ésteres de alquilo de ácidos grasos.

Un procedimiento para preparación de ésteres alquílicos de ácidos grasos,

en un sistema microacuoso exento de disolventes, el cual comprende:

- proporcionar una fuente de triglicéridos de ácidos grasos, procediendo a añadir, por etapas, un alcohol libre, o un donante de alcohol, a la citada fuente de ácidos grasos, en presencia de una preparación de lipasas, y

- permitir que avance la reacción, bajo unas condiciones que sean apropiadas, hasta que, los citados triglicéridos de ácidos grasos, se hayan convertido en éteres de alquilo de ácidos grasos,

en donde, la citada preparación de lipasas, comprende por lo menos dos lipasas, encontrándose, las citadas lipasas, inmovilizadas, de una forma separada, o conjuntamente, sobre un soporte, el cual es uno cualquiera de los soportes consistentes en un soporte a base de polímero alifático y un soporte a base de polímero aromático hidrofóbico, y en donde, por lo menos una de las citadas lipasas, tiene una afinidad incrementada, para los glicéridos parciales, y por lo menos una de las citadas lipasas, es una lipasa de posición específica sn-1,3, en donde, la citada lipasa de posición específica sn-1,3, se selecciona de entre el grupo consistente en Thermomyces lanuginose, Rhizomucor miehei, Mucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus sp., Mucor javanicus, Penicillium roqueforti, Aspergillus niger, Acromobacter sp. y Burkholderia sp. y, la citada lipasa que tiene una afinidad incrementada para los triglicéridos parciales, se selecciona de entre el grupo consistente en Candida antarctica B, Candida antarctica A, Alcaligenes sp. y Penicillium camembertii.

Uso de una preparaciïn robusta de multi-enzimas, para la sïntesis de ïsteres de alquilo de ïcidos grasos CAMPO DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn, se refiere al uso de un sistema multi-enzimïtico inmovilizado para la transesterificaciïn o esterificaciïn de aceites, y grasas triglicïridos, o de ïcidos grasos, con alcoholes de cadena corta, con objeto de obtener ïsteres de alquilo de cadena corta, de una forma preferible, para ser utilizados como biodiïsel (biocombustible) . La presente invenciïn, se refiere tambiïn al uso de tales sistemas multi-enzimïticos inmovilizados, y a sus varios usos industriales, en procedimientos a base de una etapa o de etapas mïltiples, de una forma particular, para la producciïn de ïsteres metïlicos, usados, de una forma tïpica, como biodiïsel, en conversiones aproximadamente completas.

De una forma mïs particular, las enzimas, son lipasas, las cuales se inmovilizan o de una forma separada o unida, sobre un soporte, el cual es uno cualquiera de entre los soportes a base de polïmeros alifïticos hidrofïbicos, o de entre los soportes a base de polïmeros aromïticos hidrofïbicos.

Antecedentes y trasfondo de la invenciïn Las lipasas (triacilglicerol hidrolasa E.C. 3.1.3.3) , se definen como enzimas hidrolïticas, las cuales actïan sobre el enlace del ïster en el triglicerol, en los sistemas acuosos, para proporcionar ïcidos grasos libres, glicïridos parciales y glicerol. Este grupo de enzimas, bajo una reducida actividad en agua, es capaz de catalizar su reacciïn de hidrïlisis inversa. La actividad catalïtica inversa de la lipasa, se ha venido explotando de una forma muy amplia, para la sïntesis de compuestos valiosos que contienen enlace de ïster y amida u otros compuestos quïmicos relacionados, que contengan grupos funcionales, tales como los consistentes en grupos hidroxilo, carboxïlico y amino. De una forma particular, las lipasas, se han venido utilizando para reformar las grasas, los aceites, las ceras, los fosfolïpidos y los esfingolïpidos, con objeto de nuevas propiedades funcionales que se desean, y para separar ïptimamente los compuestos ïptimamente activos de sus mezclas racïmicas. Siendo de un interïs particular, el uso de un sistema multi-enzimïtico el cual estï compuesto por diferentes lipasas inmovilizadas sobre un soporte de polïmero, ïste se discutirï para la sïntesis de los ïsteres de alquilo de cadena corta, de ïcidos grasos (biodiïsel) .

En el momento actual, existen mïs de 40 lipasas y fosfolipasas diferentes, las cuales se encuentran comercialmente disponibles en el mercado, si bien, no obstante, ïnicamente una pequeïa cantidad de ïstas, se encuentran preparadas en cantidades comerciales. Algunas de las enzimas interfaciales mïs prometedoras, desde el punto de vista industrial, son las consistentes en las que se derivan de las Candida antarctica, Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Rhizopus or y zae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Burkholderia sp., Thermomyceslanuginosa, Chromobacterium viscosum, semillas de papaya, y pancreatina.

Las tïcnicas de inmovilizaciïn de enzimas que son las mïs familiares, de una forma general, se dividen entre las que se citan a continuaciïn:

1. La adsorciïn fïsica de enzimas, a soportes sïlidos, tales como los consistentes en la sïlice y en los polïmeros 45 insolubles.

2. La adsorciïn sobre resinas de intercambio de iones.

3. El enlace covalente de las enzimas, a un material de soporte sïlido, tal como el consistente en soportes inorgïnicos epoxidados o en soportes polïmeros.

4. El atrapamiento de enzimas en un polïmero en crecimiento.

5. El confinamiento de las enzimas en un reactor membranario, o en geles semipermeables.

6. Los cristales o los agregados de reticulaciïn de enzimas.

La adsorciïn fïsica de las lipasas, basada en el uso de soportes polimïricos provistos de una alta porosidad o en el uso de las resinas de intercambio de iones, son los procedimientos de inmovilizaciïn mayormente practicados, para 55 las lipasas. Este procedimiento, se caracteriza por el hecho su simplicidad y por el hecho proporcionar una actividad sintïtica digna de confianza.

El uso de las lipasas libres o inmovilizadas, para la transesterificaciïn de los triglicïridos y para los alcoholes de cadena corta, para formar ïsteres de alquilo de ïcidos grados, ha proporcionado unos resultados que no son satisfactorios, con respecto a la actividad y a la estabilidad de la enzima. Asimismo, tambiïn, la efectividad en cuanto a lo referente a los costes de las enzimas inmovilizadas, con objeto de llevar a cabo la producciïn enzimïtica de ïsteres de alquilo de ïcidos grasos, en cantidades industriales, es todavïa prohibitivo. De una forma adicional, se ha reportado el hecho de que, la totalidad de las lipasas comercialmente disponibles en el mercado, en el momento actual, bien ya sea en su forma libre o bien ya sea en su forma inmovilizada, son incapaces de alcanzar unos grados 65 de conversiïn que sean cercanos a las conversiones completas, de una forma preferible, en unos grados de conversiïn cercanos a unos porcentajes que se encuentren por encima del 99 %, para los triglicïridos aceitosos, en ïsteres de alquilo de ïcidos grasos, en unos tiempos de reacciïn que puedan considerarse como razonables, de una forma particular, en un transcurso de tiempo inferior a 8 horas.

Otro inconveniente mayor de las lipasas, es el que resulta de su reducida tolerancia a los substratos hidrofïlicos, de una forma particular, a los alcoholes de cadena corta, a los ïcidos de cadena corta (ambos, por debajo de C4) , al agua y a la glicerina, los cuales, se encuentran presentes, de una forma tïpica, en el medio de reacciïn de la transesterificaciïn. Se ha observado, en muchos estudios de investigaciïn, el hecho de que, los alcoholes de cadena corta y los ïcidos grasos de cadena corta, tales como el metanol y el ïcido acïtico, respectivamente, son responsables para separar las molïculas de agua, de la estructura cuaternaria de tales tipos de enzimas, conduciendo, con ello, a su desnaturalizaciïn y, como consecuencia, a una pïrdida de su actividad catalïtica. Asimismo, tambiïn, la presencia de tales tipos de molïculas hidrofïlicos, en el medio de reacciïn, tiene como resultado una separaciïn de las molïculas de enzima, del soporte y, como consecuencia de ello, a una reducciïn en el tiempo de vida operacional de la enzima. Asï, por lo tanto, no es sorprendente el hecho de que, las aplicaciïn de lipasas para la producciïn de cantidades comercial de ïsteres metïlicos de ïcidos graso “biodiïsel”, en la que se utilicen triglicïridos aceitosos y metanol, como substratos, no sea susceptible de poderse realizar.

El uso de las mezclas de lipasas, se ha sugerido ya [Lee, D.H. et al., Biotechnology and Bioprocess Engineering, -Biotecnologïa e Ingenierïa de Bioprocesos -, 2006, 11 : 522 - 525]. Esta publicaciïn, describe la producciïn de biodiïsel, mediante la utilizaciïn de una mezcla de las lipasas de Rhizopus or y zae y Candid rugosa, inmovilizadas, quïmicamente enlazadas. Tal y como puede verse, el tiempo de reacciïn, era relativamente largo, siendo ïste, de una forma tïpica, el correspondiente a un transcurso de tiempo de mïs de 24 horas, para alcanzar unos grados de conversiïn de un porcentaje superior al 96 % para su conversiïn en biodiïsel. Asimismo, tambiïn, los resultados presentados en esta publicaciïn, muestran el hecho de que, la mezcla de enzimas utilizadas, perdïan un porcentaje de mïs de un 20 % de sus actividad inicial, despuïs de un uso correspondiente a un valor tan pequeïo como el de 10 ciclos. Esto podrïa atribuirse a la acumulaciïn de intermediarios glicïridos parciales, en el sistema de reacciïn, lo cual provoca la reducciïn de la reacciïn de transesterificaciïn y, asï, de este modo, se prolonga el tiempo de reacciïn. La desactivaciïn del biocatalizador, en el sistema describo en esta publicaciïn, es un inconveniente clave, el cual evita su aplicaciïn industrial.

Los documentos que se citan a continuaciïn, han reconocido tambiïn su aceptaciïn:

-Kim et al., 2007, Journal of Biotechnology, Supplement 1, 131 (2) : S 123, el cual concierne a la optimizaciïn para la producciïn de biodiïsel, mediante la utilizaciïn de una mezcla de las lipasas de Rheizopus or y zae y Candida

rugosa, inmovilizadas;

-Li et al., 2006, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 43: 58-62, el cual concierne a la transesterificaciïn catalizada mediante lipasas, de aceites de colza, para la producciïn de biodiïsel, con un nuevo disolvente orgïnico, como medio de reacciïn;

- Ranganathan... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparaciïn de ïsteres alquïlicos de ïcidos grasos, en un sistema microacuoso exento de disolventes, el cual comprende: 5

- proporcionar una fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, procediendo a aïadir, por etapas, un alcohol libre, o un donante de alcohol, a la citada fuente de ïcidos grasos, en presencia de una preparaciïn de lipasas, y

- permitir que avance la reacciïn, bajo unas condiciones que sean apropiadas, hasta que, los citados triglicïridos de ïcidos grasos, se hayan convertido en ïteres de alquilo de ïcidos grasos,

en donde, la citada preparaciïn de lipasas, comprende por lo menos dos lipasas, encontrïndose, las citadas lipasas, inmovilizadas, de una forma separada, o conjuntamente, sobre un soporte, el cual es uno cualquiera de los soportes consistentes en un soporte a base de polïmero alifïtico y un soporte a base de polïmero aromïtico hidrofïbico, y en donde, por lo menos una de las citadas lipasas, tiene una afinidad incrementada, para los glicïridos parciales, y por lo menos una de las citadas lipasas, es una lipasa de posiciïn especïfica sn-1, 3, en donde, la citada lipasa de posiciïn especïfica sn-1, 3, se selecciona de entre el grupo consistente en Thermomyces lanuginose, Rhizomucor miehei, Mucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus sp., Mucor javanicus, Penicillium roqueforti, Aspergillus niger, Acromobacter sp. y Burkholderia sp. y, la citada lipasa que tiene una afinidad incrementada para los triglicïridos parciales, se selecciona de entre el grupo consistente en Candida antarctica B, Candida antarctica A, Alcaligenes sp. y Penicillium camembertii.

2.

2. Un procedimiento para la preparaciïn de ïsteres metïlicos de ïcidos grasos (biodiïsel) , en un sistema microacuoso exento de disolventes; proporcionando una fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, procediendo a aïadir, por etapas, metanol, a la citada fuente de ïcidos grasos, en presencia de una preparaciïn de lipasas, y dejando que, la reacciïn, avance bajo unas condiciones apropiadas, hasta que el grado de conversiïn de los grupos acilo de ïcidos grasos, comprendidos en la citada fuente de ïcidos grasos, en ïsteres metïlicos de ïcidos grasos, alcance un porcentaje de por lo menos un 70 %, en donde, la citada preparaciïn de lipasas, comprende una lipasa inmovilizada, individual, inmovilizada sobre un soporte, o una mezcla de por los menos dos lipasas, inmovilizadas de una forma conjunta o por separado, sobre un soporte, en donde, el citado soporte, es uno cualquiera de los soportes a base de polïmeros alifïticos hidrofïbicos, y un soporte a base de polïmero aromïtico, hidrofïbico.

3.

3. El procedimiento de la reivindicaciïn 2, en donde, por lo menos una de las citadas lipasas, tiene una afinidad incrementada para los glicïridos parciales, y por lo menos una de las citadas lipasas es especïfica de la posiciïn sn1, 3 y, la citada preparaciïn de lipasas, comprende una tercera lipasa, la cual tiene una mayor selectividad hacia la posiciïn sn-2 que las lipasas aleatorias.

3.

4. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ï 2, en donde, la citada fuente de ïcidos grasos, comprende por lo menos una de entre el aceite de soja, el aceite de cïnola, el aceite de colza, el aceite de oliva, el aceite de ricino, el aceite de palma, el aceite de girasol, el aceite de cacahuete, el aceite de semilla de algodïn, el aceite de Jatropha, las grasas derivadas de animales, el aceite residual de cocciïn, los triglicïridos de los aceites derivados de fuentes de plantas no comestibles, o cualesquiera mezclas de por los menos dos de entre ïstos.

5. Un procedimiento microacuoso, exento de disolventes, para la preparaciïn de ïsteres de alquilo, de ïcidos grasos, de cadena corta, el cual comprende:

(a) proporcionar una fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, procediendo a aïadir, por etapas, un alcohol de cadena corta, o cualquier otro donante de alcohol de cadena corta, a la citada fuente de ïcidos grasos, en presencia de una preparaciïn de lipasas, y permitir que avance la reacciïn, bajo unas condiciones que sean apropiadas, hasta que, el grado de conversiïn de los grupos acilo de ïcidos grasos, comprendida en la citada fuente de ïcidos grasos, en ïsteres alquïlicos de cadena corta de ïcidos grasos, alcance un porcentaje de por lo menos un 70 %, en donde,

la citada preparaciïn de lipasas, comprende por lo menos una lipasa inmovilizada, individual, inmovilizada sobre un soporte, o una mezcla de por los menos dos lipasas, inmovilizadas de una forma conjunta o por separado, sobre un soporte, en donde, cada uno de los citados soportes, es uno cualquiera de los soportes a base de polïmeros alifïticos hidrofïbicos, y un soporte a base de polïmero aromïtico, hidrofïbico, al mismo tiempo que se elimina de una forma continua la glicerina formada a partir de la mezcla de reacciïn, para proporcionar una fase orgïnica que 55 contiene principalmente glicïridos residuales, no reaccionados, y los ïsteres alquïlicos de cadena corta de ïcidos grasos, formados; y

(b) hacer reaccionar la citada fase orgïnica con un alcohol libre de cadena corta, o cualquier otro donante de alcohol, en presencia de una preparaciïn de lipasas, segïn se define en la etapa (a) , bajo unas condiciones que 60 sean apropiadas, hasta que el grado de conversiïn de los grupos acilo de ïcidos grasos, comprendidos en la citada fuente de ïcidos grasos, en ïsteres metïlicos de ïcidos grasos, alcance un porcentaje de por lo menos un 95 %.

6. Un procedimiento para la preparaciïn de una mezcla de lipasas, inmovilizadas sobre un soporte insoluble, cuando se utilizan en el procedimiento de la invenciïn, comprendiendo, la citada mezcla, una lipasas derivada de la Candida antarctica B, y por lo menos una lipasa derivada de las Pseudomonas sp., Alcaligenes sp., Burkholderia sp., y Thermomyces lanuginosa., comprendiendo, el procedimiento, las etapas de:

(a) poner en contacto una soluciïn tampïn que contiene una lipasa derivada de la Candida antarctica B, y por lo menos una lipasa derivada de las Pseudomonas sp., Alcaligenes sp., Burkholderia sp., y Thermomyces lanuginosa, con un soporte polimïrico, el cual sea uno de entre el soporte a base de polïmeros alifïticos, hidrofïbicos, y el soporte a base de polïmeros aromïticos, hidrofïbicos;

(b) mezclar el sistema obtenido en la etapa (a) , durante un transcurso de tiempo de por lo menos 4 horas, a la temperatura ambiente;

(c) filtrar la mezcla de lipasas inmovilizadas, y secar ïstas, a un contenido de agua de menos de un porcentaje del 5%.

7. El procedimiento de la reivindicaciïn 6, en donde, el citado soporte insoluble, es un soporte poroso y reticular, a base de polïmero alifïtico hidrofïbico, o a base de polïmero aromïtico hidrofïbico.

8. El procedimiento de la reivindicaciïn 7, en donde, el soporte, es uno cualquiera de entre los Amberilite XAD1600, XAD 7HP, XAD 16HP, XAD 1180, Amberlite FPA53, Amberlite FPC22H, Amberlite FPA4OCl, Amberlite IRC50, un Duolite, seleccionado de entre los tipos A7, A561, A568 y Duolite C467, Amberlyst A-21, Dowex Monosphere 77, Dowex Optipore L493, Dow Styrene DVB, MTO Dowex Optipore SD-2, Dowex MAC-3, Purolire A109, y Sepabeads seleccionado entre los tipos EC - EA, EC - EP, EC - BU y EC - OD.

9. El procedimiento de la reivindicaciïn 6, en donde, en (a) , la puesta en contacto, se realiza en presencia de un disolvente orgïnico hidrofïbico que se aïade al medio de inmovilizaciïn, a unos factores de relaciïn comprendidos dentro de unos mïrgenes que van desde 1 : 10 hasta 10 : 1, referentes a tampïn : disolvente orgïnico, respectivamente.

10. El procedimiento de la reivindicaciïn 9, en donde, el disolvente orgïnico, es hexano.

11. El procedimiento, de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3, en donde, los citados ïsteres de alquilo de ïcidos grasos, son los ïsteres de hexilo, de n-octilo, de n-decilo, de n-dodecilo, de n-tetradecilo, de n-hexadecilo ï de n-octadecilo de ïcidos grasos.

12. Un procedimiento para la preparaciïn de ïsteres de alquilo de cadena corta, de ïcidos grasos, en un sistema exento de disolventes, el cual comprende: proporcionar una fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, procediendo a aïadir, por etapas, un alcohol libre de cadena corta, o un donante de alcohol de cadena corta, a la citada fuente de ïcidos grasos, en presencia de una preparaciïn de lipasas, y permitir que avance la reacciïn, bajo unas condiciones que sean apropiadas, hasta que, la citada fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, se haya convertido en ïsteres alquïlicos de cadena corta, de ïcidos grasos, en donde, la citada preparaciïn de lipasas, comprende una primera lipasa y una segunda lipasa, encontrïndose, las citadas lipasas, inmovilizadas sobre un soporte hidrofïbico, de una forma conjunta o por separado, el cual es uno cualquiera de los soportes a base de polïmeros alifïticos hidrofïbicos, y soportes a base de polïmeros aromïticos, hidrofïbicos, y en donde, la citada primera lipasa, exhibe una mayor actividad de transesterificaciïn hacia los triglicïridos, en comparaciïn con su actividad hacia los glicïridos parciales 45 y, la citada segunda lipasa, exhibe una mayor actividad de transesterificaciïn hacia los glicïridos parciales, en comparaciïn con su actividad hacia los triglicïridos, y en donde, las citadas dos lipasas, muestran un efecto sinïrgico, en su actividad de transesterificaciïn, para obtener el producto final.

13. Un procedimiento para la preparaciïn de ïsteres de alquilo de cadena corta, de ïcidos grasos, en un sistema exento de disolventes, el cual comprende: proporcionar una fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, procediendo a aïadir, por etapas, un alcohol libre de cadena corta, o cualquier otro donante de alcohol de cadena corta, a la citada fuente de ïcidos grasos, en presencia de una preparaciïn de lipasas, y permitir que avance la reacciïn, bajo unas condiciones que sean apropiadas, hasta que, la citada fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, se haya convertido en ïsteres alquïlicos de cadena corta, de ïcidos grasos, en donde, la citada preparaciïn de lipasas, comprende una 55 primera lipasa y una segunda lipasa, encontrïndose, las citadas lipasas, inmovilizadas sobre un soporte hidrofïbico, de una forma conjunta o por separado, el cual es uno cualquiera de los soportes a base de polïmeros alifïticos hidrofïbicos, y soportes a base de polïmeros aromïticos, hidrofïbicos, y en donde, la citada primera lipasa, libera intermediarios que son por lo menos uno de los monoglicïricos y diglicïridos, en un primer soporte a base de polïmeros de la reacciïn de transesterificaciïn, los cuales se favorecen mediante la citada segunda lipasa para la transesterificaciïn, con un alcohol, para formar ïsteres alquïlicos de ïcidos grasos.

14. Un procedimiento para la preparaciïn de ïsteres de alquilo de cadena corta, de ïcidos grasos, en un sistema exento de disolventes, el cual comprende: proporcionar una fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, procediendo a aïadir, por etapas, un alcohol libre de cadena corta, o cualquier otro donante de alcohol de cadena corta, a la citada 65 fuente de ïcidos grasos, en presencia de una preparaciïn de lipasas, y permitir que avance la reacciïn, bajo unas condiciones que sean apropiadas, hasta que, la citada fuente de triglicïridos de ïcidos grasos, se haya convertido en ïsteres alquïlicos de cadena corta, de ïcidos grasos, en donde, la citada preparaciïn de lipasas, comprende una primera lipasa y una segunda lipasa, encontrïndose, las citadas lipasas, inmovilizadas sobre un soporte hidrofïbico, de una forma conjunta o por separado, el cual es uno cualquiera de los soportes a base de polïmeros alifïticos 5 hidrofïbicos, y soportes a base de polïmeros aromïticos, hidrofïbicos, y en donde, las citadas lipasas, exhiben diferentes especificidades de los substratos, las cuales mantienen su actividad de transesterificaciïn, a los triglicïridos, cuando se utilizan conjuntamente, mientras que, por lo menos una de las citadas dos lipasas, se descompone, en el medio de transesterificaciïn, cuando se utilizan de una forma separada con los triglicïridos, como substrato, pero exhibe una alta actividad de transesterificaciïn / esterificaciïn, con los glicïridos parciales y los ïcidos grasos, como substratos, de una forma respectiva.

15. Un procedimiento segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 ï 12 ï 15, en donde, el procedimiento, es para la preparaciïn de ïsteres metïlicos de ïcidos grasos, y en donde, el citado alcohol de cadena corta, es el metanol.

16. Un procedimiento segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 ï 12, en donde, la preparaciïn de lipasas, comprende una tercera lipasa, la cual tiene una alta selectividad hacia la posiciïn sn-2 de la cadena de glicerol.

17. El procedimiento de la reivindicaciïn 16, en donde, la citada tercera lipasa, la cual tiene una alta selectividad hacia la posiciïn sn-2, se deriva de la Candida Antarctica A ï la Pseudozyma sp.