Soporte sólido de detección del VHC.

Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC en el que se fijan:

a) al menos un anticuerpo dirigido contra la proteína Core de VHC, y

b) un polipéptido que consiste en (i) un péptido de la proteína E2 del VHC seleccionado entre la proteína E2 en sí misma y uno o varios de sus epítopos, y (ii) un péptido de las proteínas E1, NS4B y/o NS5A del VHC seleccionado entre las proteínas en sí mismas y uno o varios de sus epítopos y, llegado el caso, en (iii) un péptido de la proteína NS3 seleccionado entre la proteína en sí misma y uno o varios de sus epítopos,

entendiéndose que ningún polipéptido que comprende un epítopo de la proteína Core del VHC está fijado sobre el soporte sólido.

Soporte sólido de detección del VHC

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico de la hepatitis C y en particular a un soporte sólido utilizable en un procedimiento de detección simultánea de un antígeno del virus de la hepatitis C (VHC) y de un anticuerpo dirigido contra una proteína del VHC.

La primera generación de ensayos para la detección de la infección por VHC se basaba en la detección de anticuerpos dirigidos contra unas proteínas no estructurales NS3/NS4 (EP 0 318 216; Choo et al. (1989) ) utilizando en particular una proteína c100-3 de aproximadamente 360 aminoácidos fusionados con la proteína superóxido dismutasa. Esta primera generación permitía sin embargo detectar sólo del 70 al 80% de los sueros infectados por el virus.

La segunda generación de ensayos, todavía basada en la detección de anticuerpos, incorporaba unos antígenos de varias regiones, en particular de la proteína de Core, y unas proteínas NS3 y NS4 (Mimms et al. (1990) ; EP 0 450 931) . Esta segunda generación representaba un progreso significativo ya que la sensibilidad superaba el 95% (Alter et al. (1992) ) .

La tercera generación de ensayos añadía a estos antígenos Core, NS3 y NS4 una proteína recombinante adicional de la región NS5 (Courouce et al. (1994) ) .

Sin embargo, esta detección se considera para los pacientes que presentan una sintomatología de la enfermedad crónica del hígado del VHC y detecta mal su fase precoz (los pacientes con sospecha de hepatitis C en fase aguda) . Por ejemplo, este formato puede dejar pasar el material sanguíneo de algunos donantes de sangre contaminados en el marco de una transfusión sanguínea. La detección del virus en sí mismo es necesaria lo antes posible después de la contaminación y antes de la aparición de los anticuerpos. Esto se realiza mediante la detección de los ácidos nucleicos con la ayuda de una técnica de amplificación de tipo PCR (reacción de polimerasa en cadena) como se describe por Garson et al. (1990) . Esta técnica, desafortunadamente, sigue siendo compleja de realizar, tanto desde el punto de vista de la preparación de la muestra, de los riesgos de contaminación, como de la automatización. Otro enfoque para la detección precoz de la infección por el VHC consiste en la detección del antígeno viral circulante de la proteína Core, como se describe por Takahashi et al. (1992) , a pesar de que la cantidad de antígeno Core detectable sea baja y que el ensayo siga siendo complejo de realizar.

Para paliar estos inconvenientes, un ensayo de detección en combinación (denominado COMBO) de los antígenos del VHC y de los anticuerpos dirigidos contra el VHC representa un buen compromiso para beneficiarse al mismo tiempo de una detección precoz, mediante la detección del antígeno, y del seguimiento de la cronicidad del paciente, mediante la detección de los anticuerpos.

Sin embargo, esto plantea un problema mayor, el de la interferencia, que se refiere a la determinación del antígeno Core del VHC, entre los anticuerpos anti-VHC presentes en el suero y unos anticuerpos anti-VHC marcados utilizados para la detección del antígeno.

Esto es particularmente cierto en un sistema de detección simultánea, en la misma fase sólida, de anticuerpos antiproteína Core del VHC y de antígeno Core del VHC. Así, el depósito sobre la fase sólida, para la detección de anticuerpos antiproteína Core del VHC, de un antígeno Core que tiene los mismos epítopos que los reconocidos por los anticuerpos antiproteína Core VHC marcados, utilizados para la detección del antígeno Core, conlleva una fijación de anticuerpos marcados en la fase sólida y da como resultado una respuesta falsamente positiva del ensayo. Del mismo modo, en un proceso de fabricación de un soporte sólido en el que se necesita fijar al mismo tiempo un antígeno Core y un anticuerpo antiproteína Core, no es posible sensibilizar la fase sólida mediante una solución en mezcla de estos dos componentes bajo pena de ver el bloqueo de los sitios anticuerpos por los antígenos utilizados para la sensibilización del soporte sólido, impidiendo su reacción ulterior con los antígenos del suero del paciente. Estos fenómenos son por lo tanto muy handicapante para realizar un ensayo eficaz.

MORADPOUR DARIUS ET AL.: "Replication of hepatitis C virus" NATURE REVIEWS. MICROBIOLOGY, vol. 5, nº 6, junio de 2007, páginas 453-463 describe la replicación del VHC y las funciones de NS4B y NS5A.

El documento WO 01/38360 divulga la utilización de un polipéptido que comprende NS4B y NS5A con fines de diagnóstico. El polipéptido puede también comprender Core y E1 o E2.SILLANPÃÃ MAARIT ET AL.: "Hepatitis C virus core, NS3, NS4B and NS5A are the major immunogenic proteins in humoral immunity in chronic HCV infection" VIROLOGY JOURNAL 2009, vol. 6, página 84 (12 páginas) indica que las proteínas Core, NS3, NS4B y NS5A representan las proteínas antigénicas mayoritarias, mientras que las proteínas E1, E2 y NS4A son minoritarias.

El documento WO 00/07023 propone un ensayo COMBO con al mismo tiempo la detección de los antígenos Core y de los anticuerpos antiproteína Core en el que, para evitar el problema de la interferencia, los epítopos de la proteína Core, seleccionados para los diferentes componentes del kit, son diferentes. Los epítopos Core no están en número ilimitado, por lo tanto esta técnica presente el inconveniente de utilizar unos epítopos menores y poco reconocidos.

Un enfoque parecido, pero sistematizado para combinar un máximo de epítopos no solapantes de la proteína Core y de anticuerpos monoclonales antiproteína Core, se describe en el documento WO 2008/027942, siempre para evitar este problema de interferencia.

El documento EP 1 251 353 utiliza la misma técnica, pero con una mezcla de antígenos más completa (NS3, NS4, NS5, Core) para la detección de los anticuerpos, pero aún con este problema de interferencia para la proteína Core.

El documento WO 03/095968 resuelve este problema modificando estructuralmente, en particular por sustitución de aminoácidos, ciertos epítopos diana de los antígenos utilizados para la captura de anticuerpos. Los epítopos así modificados son entonces destruidos. Simultáneamente, los anticuerpos utilizados para la captura y/o la detección de los antígenos son los seleccionados de tal manera que reconocen precisamente unos epítopos no modificados presentes en los antígenos del paciente, y que no puedan así unirse a los antígenos modificados, que no presenten ya estos mismos epítopos. Puesto que los epítopos ya no son idénticos, ya no existe por lo tanto competición entre los anticuerpos utilizados para capturar y/o detectar el antígeno de VHC y los anticuerpos del paciente. La captura del antígeno Core y la de los anticuerpos antiproteína Core podrán realizarse en una sola y misma zona proteica de la proteína Core y evitarán la pérdida de detección de un cierto número de anticuerpos antiproteína Core. Una estrategia parecida se describe en el documento WO 03/002749 en el que la proteína Core está modificada para que ciertos epítopos no sean reconocidos por los anticuerpos monoclonales utilizados en el ensayo.

El documento WO 01/096875 describe un ensayo COMBO en el que este problema de interferencia se resuelve combinando la detección den antígeno Core del VHC y unos anticuerpos dirigidos contra los epítopos discontinuos presentes en la proteína de 680 aminoácidos (aa) de NS3/NS4a. Pero los resultados en sensibilidad/especificidad son muy limitados en esta solicitud y no está demostrado que el nivel de sensibilidad sea suficiente para un ensayo de detección.

Existe por lo tanto una necesidad para un ensayo de detección del VHC combinado de antígeno y anticuerpo que sea sensible y específico, lo más sencillo posible y que evite el problema de la interferencia entre los antígenos y los anticuerpos dirigidos contra la proteína Core.

Para este fin, se ha encontrado un soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC, en el que se fija:

a) al menos un anticuerpo dirigido contra la proteína Core de VHC,

b) y al menos un polipéptido que comprende al menos un epítopo de la proteína E2 del VHC, y al menos un epítopo de una proteína seleccionada entre las proteínas E1, NS3, NS4, NS5 del VHC,

y en el que dicho al menos un polipéptido no comprende un epítopo de la proteína Core del VHC.

En particular, sobre el soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección de VHC, se fija:

a) al menos un anticuerpo dirigido contra la proteína Core de VHC,

b) y al menos un polipéptido que comprende al menos un epítopo de la proteína E2 del VHC,

1. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC en el que se fijan:

a) al menos un anticuerpo dirigido contra la proteína Core de VHC, y

b) un polipéptido que consiste en (i) un péptido de la proteína E2 del VHC seleccionado entre la proteína E2 en sí misma y uno o varios de sus epítopos, y (ii) un péptido de las proteínas E1, NS4B y/o NS5A del VHC seleccionado entre las proteínas en sí mismas y uno o varios de sus epítopos y, llegado el caso, en (iii) un péptido de la proteína NS3 seleccionado entre la proteína en sí misma y uno o varios de sus epítopos,

entendiéndose que ningún polipéptido que comprende un epítopo de la proteína Core del VHC está fijado sobre el soporte sólido.

2. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 1, caracterizado por que el péptido (ii) se selecciona entre las proteínas NS4B, NS5A y uno o varios de sus epítopos.

3. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 2, caracterizado por que el péptido (ii) comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 5 y/o de la SEC ID nº 7.

4. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 1 a 3, caracterizado por que el péptido (i) comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 2.

5. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 1 a 4, caracterizado por que el polipéptido b) no comprende ningún péptido (iii) .

6. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC, en el que están fijados: a) al menos un anticuerpo dirigido contra la proteína de Core del VHC, b) un péptido de la proteína E2 del VHC seleccionado entre la proteína E2 en sí misma o uno o varios de sus

epítopos y

c) un péptido de las proteínas E1, NS4B y/o NS5A del VHC seleccionado entre las proteínas en sí mismas y uno o varios de sus epítopos, con, llegado el caso d) un péptido de la proteína NS3 seleccionado entre la proteína en sí misma y uno o varios de sus epítopos. entendiéndose que ningún polipéptido que comprende un epítopo de la proteína Core del VHC está fijado sobre el

soporte sólido.

7. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 6, caracterizado por que el péptido c) se selecciona entre las proteínas NS4B, NS5A y uno o varios de sus epítopos.

8. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 7, caracterizado por que el péptido c) comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 5 y/o SEC ID nº 7.

9. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 6 a 8, caracterizado por que el péptido b) comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 2.

10. Soporte sólido de ensayo inmunológico para la detección del VHC según la reivindicación 6 a 9, el cual no comprende ningún péptido de la proteína NS3 d) .

11. Procedimiento de detección in vitro de una infección por el VHC en una muestra biológica que comprende la detección de al menos un antígeno del VHC y de un anticuerpo dirigido contra el VHC presente en la muestra biológica, y en el que

se dispone de un soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,

se incuba dicho soporte con la muestra biológica en condiciones que permiten la formación de complejos antígenosanticuerpos,

se revelan los complejos antígenos-anticuerpos formados.