Selección de cepas fúngicas útiles.

Un método para la detección de un hongo filamentoso con mayor eficacia de utilización de carbono que comprende:

(i) el análisis de una población de hongos filamentosos de prueba con un sustrato de celulosa para la detección de una subpoblación de hongos filamentosos con un índice de metabolismo predeterminado que presenta índices de crecimiento superiores a los del percentil 50 en el índice de crecimiento de dicha población de hongos de prueba y, (ii) la selección de un hongo filamentoso a partir de dicha subpoblación de hongos filamentosos basada en la producción de una celulasa con mayor actividad específica en comparación con células parentales del hongo filamentoso, que indica una mayor eficacia de utilización de carbono de dicho hongo filamentoso seleccionado.

Selección de cepas fúngicas útiles

3. INTRODUCCIÓN

Los hongos filamentosos son productores eficaces de enzimas de celulasa y se han explotado por su capacidad para producir estas enzimas. Las celulasas son valiosas comercialmente en las industrias textiles, de detergente y de papel, y cada vez más para la producción de biocombustibles, que requiere la hidrólisis de materia vegetal a azúcares fermentables. Se encuentran tres tipos mayoritarios de actividades enzimáticas: exoglucanasas o exocelobiohidrolasas, endoglucanasas y β-glucosidasas. Estos tres tipos diferentes de enzimas de celulasa actúan de forma sinérgica para convertir celulosa en glucosa.

Schimenti et. al. (Mycologia, vol.75, núm.5, pp. 876-880, 1983) describe la selección de mutantes hipercelulolíticos de Trichoderma reesei basada en la resistencia a la nistatina.

Kuek et. al. (Biotechnology Letters 1984, vol.6, núm.9, pp.561-566) describe la detección de hongos para una productividad de glucoamilasa mejorada utilizando cultivos de caldo de dextrano en tampón.

Montenecourt B S (Trends in Biotechnology 1983, vol.1, núm.5, pp.156-161) describe celulasas de 15 Trichoderma reesei.

Es necesario identificar los hongos filamentosos deseados, especialmente hongos filamentosos con rendimiento y producción de proteína deseados, por ejemplo, elevado rendimiento y/o producción de enzimas de celulasa.

4. DESCRIPCIÓN

La presente información dada a conocer se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden combinar ciertos parámetros en el proceso de detección de hongos filamentosos deseados. Por consiguiente, la presente información dada a conocer proporciona métodos para la detección de un hongo filamentoso deseado basada en al menos dos parámetros, por ejemplo, parámetros asociados con el metabolismo y el uso de carbono, según se describe en las reivindicaciones adjuntas.

En algunos modos de realización, la presente información dada a conocer proporciona un método para la detección de un hongo filamentoso deseado. Específicamente, la presente invención proporciona un método, según se explica en la reivindicación 1, para la detección de un hongo filamentoso con mayor eficacia de utilización de carbono. Aquí, se analiza una población de hongos filamentosos de prueba (también denominados en el presente documento “hongos filamentosos en prueba”) para la detección de una subpoblación de hongos filamentosos con un índice de metabolismo predeterminado. Un hogo filamentoso se selecciona de entre la subpoblación de hongos filamentosos basándose en un parámetro de selección predeterminado que indica la eficacia de utilización de carbono del hongo filamentoso en prueba. La descripción también proporciona un hongo filamentoso obtenido mediante este método de detección.

Aunque no de acuerdo con la invención según se reivindica, la presente información dada a conocer

podría proporcionar también un método para la detección de un hongo filamentoso en el que se analiza una población de hongos filamentosos de prueba basándose en un primer parámetro de selección y un segundo parámetro de selección. El primer parámetro de selección indica el índice de metabolismo de un hongo filamentoso de prueba y el segundo parámetro de selección indica la capacidad de un hongo filamentoso en prueba para resistir a un antibiótico.

La presente información dada a conocer también proporciona un método para la detección de un hongo filamentoso en el que se preselecciona una población de hongos filamentosos de prueba frente a un antibiótico y se analiza basándose en un parámetro de selección predeterminado que indica el índice de metabolismo de un hongo filamentoso de prueba.

Estas y otras características de la presente información dada a conocer se describen a continuación.

5. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

El experto en la materia entenderá que los dibujos son sólo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la presente información dada a conocer.

La figura 1 muestra la mejora de producción de proteína en la cepa A83 en comparación con la cepa 41G.

La figura 2 muestra la ventaja de actividad específica de la cepa 41G en comparación con la cepa A83.

La figura 3 muestra la evolución de la cepa A83 y las mejoras en rendimiento (recuadro gris) y productividad (recuadro blanco) .

La figura 4 muestra los resultados de 41G y A83 en un ensayo de sacarificación.

6. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE VARIOS MODOS DE REALIZACIÓN

La presente información dada a conocer se describirá en detalle a continuación a modo de referencia únicamente utilizando las siguientes definiciones y ejemplos. A menos que se defina de otra manera en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto habitual en la materia al cual pertenece esta invención. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los encabezamientos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modos de realización, que se pueden tomar haciendo referencia a la memoria en conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación están definidos más exhaustivamente haciendo referencia a la memoria en conjunto.

EL término “polipéptido”, según se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto formado por una sola cadena de residuos de aminoácidos unidos por enlaces péptidos. El término “proteína”, según se utiliza en el presente documento, se emplea indistintamente con el término “polipéptido”.

Los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido” se emplean indistintamente e incluyen ADN, ARN ADNc, monocatenario o bicatenario y modificaciones químicas de los mismos. Puesto que el código genético se degenera, se puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido concreto, y la presente descripción incluye todos los polinucleótidos, que codifican una secuencia de aminoácidos concreta.

Los términos “recuperado”, “aislado” y “separado” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a una proteína, célula, ácido nucleico, aminoácido, etc. que se elimina de al menos un componente con el que está asociado de forma natural.

Según se utiliza en el presente documento, el término “gen” se refiere a un polinucleótido (p. ej., un segmento de ADN) que participa en la producción de una cadena de polipéptidos, que puede o no incluir las regiones anterior y posterior a la región de codificación, por ejemplo, la secuencia 5’ no traducida (5’-UTR) o secuencia “líder” y la secuencia 3’-UTR o secuencia “tráiler”, así como secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos de codificación individuales (exones) .

Según se utiliza en el presente documento, el término “expresión” se refiere al proceso por el que se produce un polipéptido basado en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

Según se utiliza en el presente documento, el término “expresión” se refiere al proceso por el que se produce un polipéptido basado en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

El término “proteína segregada” se refiere a una región de un polipéptido que se libera de una célula durante la secreción de proteínas. En algunos modos de realización, la proteína segregada es la proteína que se libera o escinde de un polipéptido de fusión recombinante.

El término “secreción” se refiere al movimiento selectivo de una proteína a través de una membrana en una célula huésped al espacio extracelular y los medios circundantes.

Según se utiliza en el presente documento, los términos “producido” o “producción de”, especialmente en 40 lo que se refiere a proteínas o enzimas, se refiere a la expresión y/o secreción de la proteína o enzima.

Según se utiliza en el presente documento, el término “cultivo” se refiere a hacer crecer una población de células bajo condiciones adecuadas en un medio líquido, semisólido o sólido.

Según se utiliza en el presente documento, “sustituido” y “modificado” se utilizan indistintamente y se refieren a una secuencia,... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de un hongo filamentoso con mayor eficacia de utilización de carbono que comprende:

(i) el análisis de una población de hongos filamentosos de prueba con un sustrato de celulosa para la detección de una subpoblación de hongos filamentosos con un índice de metabolismo predeterminado que presenta índices de crecimiento superiores a los del percentil 50 en el índice de crecimiento de dicha población de hongos de prueba y,

(ii) la selección de un hongo filamentoso a partir de dicha subpoblación de hongos filamentosos basada en la producción de una celulasa con mayor actividad específica en comparación con células parentales del hongo filamentoso, que indica una mayor eficacia de utilización de carbono de dicho hongo filamentoso seleccionado.

2. Método de la reivindicación 1, donde el parámetro de selección corresponde a la producción de una celulasa con mayor actividad específica en el hongo filamentoso seleccionado en relación a una cantidad predeterminada de carbono proporcionada al hongo filamentoso de prueba.

3. Método de la reivindicación 1, donde el parámetro de selección corresponde a la producción de una celulasa con mayor actividad específica en el hongo filamentoso seleccionado en relación a una cantidad predeterminada de carbono consumido por el hongo filamentoso de prueba.

4. Método de la reivindicación 1, que comprende la determinación de la productividad de la celulasa en el hongo filamentoso seleccionado mediante la determinación de la producción de la celulasa en un periodo de tiempo 20 predeterminado en relación a una cantidad predeterminada del hongo filamentoso seleccionado.

5. Método de la reivindicación 1, donde el análisis de la población de hongos filamentosos de prueba para la detección de la subpoblación se lleva a cabo en un ensayo de fase sólida.

6. Método de la reivindicación 1, donde la población de hongos filamentosos de prueba es una población de hongos filamentosos preseleccionados frente a un antibiótico, que es opcionalmente un antibiótico poliénico y/o

que se selecciona opcionalmente del grupo consistente en nistatina, anfotericina B, bialafos, ciclohexamidina, tunicamicina, griseofulvina, nikomicina Z, caspofungina, actinomicina D, brefeldina A e higromicina.

7. Método de la reivindicación 1, donde el hongo filamentoso de prueba se selecciona del grupo consistente en Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauveria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium, Paecilomyces, Chr y sosporium, Claviceps, Cochiobolus, Cr y ptococcus, Cyathus, Endothia, Fusarium,

Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neurospora, Phanerochaete, Podospora, Paecilomyces, Penicillium, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton, Trametes, y Pleurotus.

8. Método de la reivindicación 1, donde el hongo filamentoso de prueba es T. reesei y utiliza celulosa como 35 fuente de carbono.

Dibujos % de actividad específica (g proteína/g DCW/LH de A-83 (control)