Receptores multiméricos de TNF.

Una proteína de fusión que comprende

(i) un dominio extracelular del receptor de la familia de TNF seleccionado entre TNFRSF6 de acuerdo con la SEC ID Nº 6

(ii) un elemento enlazador flexible que tiene una longitud de 2-20 aminoácidos entre los componentes (i) y (iii),

y

(iii) un dominio de trimerización, seleccionado entre el grupo (G)YIEDAPSDGK FYVRKDGAWV ELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70% con la misma, donde el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) está localizado de forma Cterminal.

Receptores multiméricos de TNF

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un dominio extracelular de la familia de receptores de TNF fusionado a un dominio de trimerización, y a una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. La proteína de fusión puede estar presente como un complejo trimérico. Es adecuada para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o investigación. Las proteínas de fusión triméricas que comprenden el dominio extracelular de un receptor de la familia TNF y un dominio Fc de inmunoglobulina son conocidas (por ejemplo, documento WO 95/27735) . Esta proteína de fusión es adecuada para el tratamiento de trastornos autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedador, apoplejía, infarto de miocardio o paraplejía.

El documento WO 02/090553 describe proteínas de fusión de receptores de TNF con proteínas de trimerización tales como colectina, conectadas por secuencias enlazadoras de más de 2 o 5 aminoácidos.

El documento WO 2004/033486 muestra que antagonistas basados en receptor trimérico deben presentar una avidez aumentada y por lo tanto, eficacia aumentada en comparación con moléculas diméricas. El documento WO 2004/033486 describe un polipéptido de interés y una secuencia de aminoácidos de trimerización, donde los polipéptidos de interés incluyen los dominios extracelulares de receptores. Los receptores adecuados incluyen receptores del factor de necrosis tumoral.

El documento WO 02/00893 describe que los receptores de la superfamilia de TNF son polipéptidos que pueden multimerizarse, incluyendo Fas (CD95R) . El documento WO 02/00893 muestra varios dominios que provocan trimerización, por ejemplo, colectina.

El documento WO 2008/025516 describe el uso del dominio de fibritina de RB69 como un dominio de trimerización para una proteína de fusión que comprende un dominio de unión del receptor de la superfamilia de TNF, un enlazador flexible, y un dominio de trimerización que es idéntico a la SEC ID Nº 45.

Un objeto de la presente invención fue proporcionar nuevos agentes basados en dominios extracelulares del receptor de la familia TNF que tienen propiedades farmacéuticas mejoradas.

Por tanto, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende (i) un dominio extracelular del receptor de la familia TNF seleccionado entre TNFRSF6 de acuerdo con la SEC ID Nº 6,

(ii) un elemento enlazador flexible que tiene una longitud de 2-20 aminoácidos entre los componentes (i) y (iii) , y

(iii) un dominio de trimerización seleccionado entre el grupo (G) YIEDAPSDGKFYVRKDGAWVELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70% con la misma donde el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) está localizado de forma C-terminal.

La proteína de fusión puede ser una proteína monomérica o una proteína trimérica. Preferiblemente, la proteína de fusión se presenta como un complejo trimérico que consiste en tres unidades monoméricas idénticas. El complejo trimérico puede asociarse por interacciones no covalentes y/o covalentes mediadas por el dominio de trimerización.

Además, el complejo trimérico puede estabilizarse por reticulación química, por ejemplo mediante un enlazador homo-o hetero-multifuncional tal como suberato de (bis) sulfosuccinimidilo.

El componente (i) de la proteína de fusión es un dominio de unión extracelular de un receptor de la familia TNF. Preferiblemente, el componente (i) es un dominio extracelular del receptor de la familia TNF de mamífero, particularmente humano, incluyendo variantes alélicas y/o derivados del mismo. El receptor de la familia TNF se selecciona entre TNFRSF6 (CD95R, FAS; SEC ID Nº 6) . La estructura de este receptor y la localización del dominio extracelular del mismo se describe en un artículo de revisión de Wajant et al. (2003) , Essays in Biochemistr y 39, 53

71. Puede usarse una diversidad de fragmentos que comprenden todo o una parte del dominio extracelular del receptor de TNF (incluyendo el dominio de unión a ligando) para la producción de proteínas triméricas TNFR-SF.

Las regiones para la producción de proteínas triméricas TNFR-SF se mencionan en la Fig. 6, mientras que la invención se limita a TNFRSF6.

Se muestra un dibujo esquemático de la estructura de dominio de CD95R (Fas) de acuerdo con Wajant et al. (2003) , supra, en la Fig. 1. La numeración se refiere a la proteína madura. L significa la secuencia señal secretora, CRD un dominio rico en cisteínas, TM un dominio transmembrana y PLAD un dominio de ensamblaje de unión pre-ligando. En una realización especialmente preferida, el componente (i) de la proteína de fusión recombinante se selecciona entre el dominio extracelular del receptor de CD95 humano que comprende los aminoácidos 1 a 169 de la proteína CD95R madura.

El componente (ii) es un elemento enlazador flexible localizado entre los componentes (i) y (iii) . El elemento enlazador flexible tiene una longitud de 2-20 aminoácidos. El elemento enlazador es preferiblemente un enlazador

de glicina/serina, es decir, un enlazador peptídico que consiste sustancialmente en los aminoácidos glicina y serina. En una realización especialmente preferida, el enlazador tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (GSS) a (GSG) b (SEC ID Nº 41) y (GTT) a (GTG) b (SEC ID Nº 42) donde a o b es 0, 1, 2, 3, 4 o 5, donde cuando a=0 entonces b es 1 y cuando b=0 entonces a es 1. Es evidente para los especialistas en la técnica que en casos en que el dominio extracelular del receptor de la familia TNF o el dominio de unión a ligando del mismo ya termina con una G, dicha G puede formar la primera G del enlazador en la secuencia enlazadora. También es evidente para los especialistas en la técnica que en casos en que el dominio de trimerización ya empieza con una G, dicha G puede formar la última G del enlazador en la secuencia enlazadora.

El componente (iii) es un dominio de trimerización. El componente (iii) es un dominio de trimerización de fibritina de bacteriófago del bacteriófago RB69. El componente (iii) comprende la secuencia de aminoácidos (G) YIEDAPSDGK ELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45, o una variante de secuencia que tiene una identidad de al menos el 70%, 75%, 80%, 85% o preferiblemente de al menos el 90% con la misma. Ejemplos de variantes de secuencia preferidas se muestran en el documento PCT/EP2007/007517. Se prefiere que el componente (iii) tenga una longitud de 20

hasta 30 aminoácidos.

En otra realización preferida adicional, el dominio de trimerización puede glucosilarse de forma artificial, lo que puede conferir solubilidad potenciada a la proteína y puede ser útil para modular la farmacocinética sin limitarse a la misma.

De acuerdo con la norma de N-glucosilación normalmente aceptada, se requiere una secuencia consenso tripeptídica que consiste en N-X-S/T para la N-glucosilación de proteínas.

En la proteína de fusión de la invención, el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) 25 está localizado de forma C-terminal.

La proteína de fusión puede comprender adicionalmente un dominio peptídico señal N-terminal, que permite el procesamiento, por ejemplo la secreción extracelular, en una célula hospedadora adecuada. Preferiblemente, el dominio peptídico señal N-terminal comprende una proteasa, por ejemplo, un sitio de escisión por peptidasa señal y por tanto puede eliminarse después de o durante la expresión para obtener la proteína madura. Además, la proteína de fusión puede comprender adicionalmente un elemento flexible C-terminal, que tiene una longitud de por ejemplo 1-50, preferiblemente 10-30 aminoácidos que puede incluir o conectar con un dominio de reconocimiento/purificación, por ejemplo un dominio FLAG, un dominio Strep-tag y/o un dominio poli-His.

La Figura 2 muestra un dibujo esquemático de una proteína de fusión preferida de la presente invención que comprende un dominio peptídico señal N-terminal (SP) , el dominio CD95 extracelular (E-CD95) , un enlazador flexible (GSS) 3 GS, un motivo de trimerización, un espaciador adicional, por ejemplo un espaciador de serina para proporcionar flexibilidad de las marcas de purificación y una secuencia de marca (St) , por ejemplo el dominio Streptag.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se ha descrito anteriormente. La molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN, por ejemplo una molécula de ADN bicatenaria o monocatenaria, o una molécula... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión que comprende

(i) un dominio extracelular del receptor de la familia de TNF seleccionado entre TNFRSF6 de acuerdo con la SEC ID Nº 6

(ii) un elemento enlazador flexible que tiene una longitud de 2-20 aminoácidos entre los componentes (i) y (iii) , y

(iii) un dominio de trimerización, seleccionado entre el grupo (G) YIEDAPSDGK FYVRKDGAWV ELPTA de acuerdo con la SEC ID Nº 45 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 70% con la misma,

donde el componente (i) está localizado de forma N-terminal y el componente (iii) está localizado de forma Cterminal.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el receptor de la familia de TNF se selecciona entre los aminoácidos 1 a 169 de TNFRSF6 humano maduro de acuerdo con la SEC ID Nº 6.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 2, donde el componente (iii) comprende al menos una sustitución de aminoácido.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 3, donde el componente (iii) comprende un mutante que no se une a manosa.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, 2 o 4 donde el componente (iii) comprende los aminoácido.

11. 271.

11. 271, .

12. 271 .

11. 147.

11. 148.

11. 149.

11. 150.

11. 151.

11. 147.

11. 148.

11. 149.

11. 150.

11. 151.

12. 147.

12. 148.

12. 149.

12. 150, .

12. 151 de colectina-11 humana de la SEC ID Nº 60.

6. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones previas que comprende adicionalmente un dominio peptídico señal N-terminal, que puede comprender un sitio de escisión por proteasa o/y un elemento flexible Cterminal que puede comprender y/o conectar con un dominio de reconocimiento/purificación.

7. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones previas que está presente como un complejo trimérico, donde el complejo puede consistir en tres proteínas de fusión idénticas.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones previas.

9. Una célula transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Un organismo no humano transformado o transfectado con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación

8.

11. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

12. Una composición de diagnóstico que comprende como agente activo una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.