Prueba para predecir la neutralización de actividad de asparaginasa.

Un procedimiento para predecir si una asparaginasa puede ser o no activa en un paciente,

en el quese mide in vitro la presencia de factores que neutralizan la actividad de asparaginasa en una muestra de sangre,plasma, suero o medio derivado que puede contener dichos factores neutralizantes, obtenidos de dicho paciente,procedimiento que comprende mezcla de dicha muestra con dicha asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luegomedición de la actividad residual de dicha asparaginasa en la mezcla, y determinación o cuantificación de lapresencia de dichos factores neutralizantes.

Prueba para predecir la neutralización de actividad de asparaginasa [0001] La invención se refiere a una prueba para diagnosticar la capacidad de un paciente para responder a tratamiento con la enzima terapéutica asparaginasa. En particular se refiere a una prueba para predecir la eficacia de un tratamiento usando asparaginasa en un paciente dado como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La L-asparaginasa es un componente esencial de los protocolos de quimioterapia que se han usado durante más de 30 años para el tratamiento de leucemias linfoblásticas agudas. Su mecanismo de acción se basa en la hidrólisis del aminoácido plasmático asparagina, un elemento esencial para el crecimiento tumoral de linfoblastos. A diferencia de las células normales, las células linfoblásticas cancerosas son incapaces de producir su asparagina por sí mismas, y dependen de fuentes extracelulares. El tratamiento con asparaginasa las priva de este constituyente esencial y así provoca su muerte.

La enzima producida a partir de microorganismos se comercializa actualmente en tres formas: las dos primeras se derivan de fuentes bacterianas Escherichia coli y Erwinia chr y santhemi, la tercera se obtiene por acoplamiento de enlace covalente de polietilenglicol con la asparaginasa nativa de Escherichia coli (PEGasparaginasa) .

A pesar de su eficacia antileucémica considerable, el tratamiento con asparaginasa está asociado a un cierto número de complicaciones conectadas a la inmunogenicidad de la enzima. Estas complicaciones pueden reflejarse en manifestaciones clínicas o en inactivación silenciosa.

Se han informado reacciones de hipersensibilidad, con gravedad variable de reacción alérgica moderada a choque anafiláctico, por muchos autores (Wang y col., Journal of Immunological Methods 239 (200) 7583) . El desarrollo de reacciones de este tipo, observadas con las tres formas de asparaginasa, generalmente conduce a la suspensión del tratamiento por miedo a una reacción más grave.

Además, la asparaginasa produce la aparición de anticuerpos circulantes que poseen propiedades neutralizantes, reflejadas en un aumento en la eliminación de la enzima por el sistema reticuloendotelial y una disminución en su eficacia terapéutica (Müller H.J., Boos J. Crit Rev Oncol/hematol 1998; (28) :97-113) . Estos anticuerpos se han observado con las tres formas de la enzima (E. coli, Erwinia y PEG-asparaginasa) , y en este caso no se consigue el objetivo terapéutico de la asparaginasa, que es lograr el rápido y completo agotamiento de la asparagina plasmática, durante un periodo prolongado.

Esta inactivación de la enzima por factores neutralizantes, principalmente anticuerpos, presentes en el suero del paciente no está acompañada de signos clínicos, es silenciosa para el profesional clínico.

Por tanto, los inventores han identificado que hay una considerable necesidad de profesionales clínicos que tengan a su disponibilidad una prueba que sea rápida y sea fácil de usar para predecir la presencia de factores neutralizantes de asparaginasa, principalmente anticuerpos, presentes en suero del paciente. Esta prueba haría posible ajustar la dosis de enzima administrada o sustituir la asparaginasa usada con otra forma de asparaginasa que no es sensible, o es menos sensible, a estos factores neutralizantes.

Se consideraron varias posibilidades para monitorizar la actividad de asparaginasa en un paciente:

• Ensayo de L-asparaginasa en plasma 50 • Ensayo de la actividad de L-asparaginasa en plasma • Ensayo de anticuerpos anti-asparaginasa [0010] El nivel de asparagina en plasma es el principal parámetro bioquímico que refleja el efecto terapéutico 55 que se desea con asparaginasa: un agotamiento rápido, completo y de larga duración de asparagina. Por consiguiente, se han descrito varios procedimientos para su ensayo. La mayoría de ellos se basan en combinar una etapa de separación de los constituyentes de la muestra que va a ensayarse por cromatografía de líquidos de alto rendimiento y detección o cuantificación fluorométrica por espectrometría de masas. Estos procedimientos son tediosos, requieren personal entrenado y su coste y el tiempo necesario son incompatibles con el uso clínico rutinario.

Más recientemente, Verma y col. describieron un procedimiento para el rápido ensayo de asparagina basándose en la co-inmovilización de L-asparaginasa y un indicador coloreado sobre diversos sustratos (membrana de nitrocelulosa, gel de silicona o perlas de alginato de calcio) . Cuando uno de estos soportes se pone en contacto con una muestra de suero de un paciente, la L-asparaginasa inmovilizada degradará la asparagina presente. La producción de amonio tras esta reacción de hidrólisis conducirá a un cambio de color del indicador de rojo fenol. Aunque este procedimiento parece cumplir los requisitos de simplicidad y velocidad de uso, los autores no suministran datos por los que pueda validarse, y todavía hay dudas sobre su exactitud.

Aparte de la ausencia de procedimientos validados que puedan usarse fácilmente y rápidamente, el ensayo de L-asparaginasa en plasma está limitado por las siguientes consideraciones. In vivo, la degradación de asparagina por la acción de asparaginasa está contrarrestada por la producción fisiológica de asparagina mientras que, in vitro, el efecto catalítico de la enzima sobre la asparagina persistirá. Como consecuencia directa, cuando una muestra de suero se toma de un paciente tratado con asparaginasa, la presencia de una cantidad residual de enzima conducirá a un sesgo en la medición del nivel de asparagina, que será “falsamente” menor que el nivel fisiológico (Boos y col., European Journal of Cancer (1996) 32, 1544-1550) . Esta interferencia en el procedimiento analítico resulta en ausencia de correlación con la actividad fisiológica de asparaginasa en el paciente probado.

Se han descrito varios procedimientos para el ensayo de L-asparaginasa en plasmas, y aquellos usados casi siempre se basan en la incubación de suero que contiene L-asparaginasa en un tampón que contiene Lasparagina, entonces, después de detener la reacción, la determinación del amonio se produjo usando reactivo de Nessler. Orsonneau y col. propusieron una variante más rápida y más precisa, con la que pacientes tratados con Lasparaginasa pueden monitorizarse (J.L. Orsonneau y col. Ann Biol Clin 2004, 62: 568-72) . Este procedimiento se basa en la acción de glutamato deshidrogenasa, que usa el amonio producido durante la hidrólisis de L-asparagina por L-asparaginasa para convertir α-cetoglutarato en ácido glutámico.

Glutamato deshidrogenasa α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH - L-glutamato + NADP + H2O

En esta reacción, la cantidad de NADPH oxidada en el transcurso de la reacción es equivalente a la cantidad de amoniaco contenida en la muestra y puede determinarse midiendo la disminución en la densidad óptica. La cinética de la aparición de amonio puede así monitorizarse y la actividad de la L-asparaginasa puede calcularse. Aunque este procedimiento hace posible monitorizar la actividad de L-asparaginasa en un paciente, no da ninguna información predictiva referente a la neutralización de esta enzima por factores presentes en el suero.

Wang y col. desarrollaron una prueba de ELISA normalizada para cuantificar IgG anti-asparaginasa en muestras de plasma de pacientes (B. Wang y col., Journal of Immunological Methods 239 (2000) 75-83) . Esta prueba se usó dentro del alcance de un estudio clínico para medir la concentración de anticuerpos anti-asparaginasa presentes en el suero de pacientes con leucemia linfoblástica aguda, tratados con L-asparaginasa y que desarrollaron o no desarrollaron una reacción alérgica (M.H. Woo y col., Leukemia (1998) 12, 1527-1533) . Los autores pudieron mostrar que la mediana de la concentración de anticuerpos anti-asparaginasa fue mayor en los pacientes que desarrollaron una reacción alérgica independientemente de si la medición se lleva a cabo o no antes o después de que se haya producido dicha reacción. Llegan a la conclusión de que hay un beneficio en la práctica clínica de usar una prueba tal para predecir el futuro desarrollo de una reacción alérgica.

Sin embargo, el valor predictivo de una prueba tal puede cuestionarse; los intervalos de variación de la concentración de anticuerpos anti-asparaginasa medidos antes del desarrollo de una reacción alérgica se solapan, son respectivamente:

• de 0, 001 a 0, 375 unidades de DO para los pacientes que desarrollaron una reacción alérgica posteriormente;

• de 0, 004 a 0, 064 unidades de DO para los pacientes que no desarrollaron una reacción alérgica posterior

Además,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para predecir si una asparaginasa puede ser o no activa en un paciente, en el que se mide in vitro la presencia de factores que neutralizan la actividad de asparaginasa en una muestra de sangre,

plasma, suero o medio derivado que puede contener dichos factores neutralizantes, obtenidos de dicho paciente, procedimiento que comprende mezcla de dicha muestra con dicha asparaginasa, incubación de dicha mezcla, luego medición de la actividad residual de dicha asparaginasa en la mezcla, y determinación o cuantificación de la presencia de dichos factores neutralizantes.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es de un paciente que actualmente está tratándose con una asparaginasa o de un paciente que se ha tratado con una asparaginasa.

3. El procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la medición de la actividad residual de asparaginasa en la mezcla se lleva a cabo añadiendo, a dicha mezcla, asparagina y un sistema de reactivos 15 adecuados para ensayar la actividad enzimática residual.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas:

(a) incubación de la muestra con una cantidad conocida de dicha asparaginasa; 20

(b) incubación de dicha mezcla con una cantidad conocida de asparagina;

(c) incubación de dicha mezcla con el sistema de reactivos adecuados para ensayar la actividad enzimática residual;

(d) evaluación cualitativa o cuantitativa de la pérdida o retención de actividad enzimática, que se correlaciona con la presencia o con el contenido de factores neutralizantes de dicha asparaginasa en la muestra.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende, antes de la etapa (a) , una etapa (a0) de eliminación o inactivación de cualquier asparaginasa que puede estar presente en la muestra. 30

6. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende, antes de la etapa (a) , una etapa (a0) de medición del contenido de referencia de asparaginasa en la muestra.

7. El procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el sistema de reactivos es sensible 35 a la aparición del ión amonio resultante de la degradación enzimática de asparagina por asparaginasa.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, que emplea una reacción que consume el ión amonio cuantitativamente.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el consumo cuantitativo del ión amonio se mide midiendo la disminución en densidad óptica de la mezcla.

10. El procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 9, que emplea las siguientes reacciones:

(1) asparaginasa + asparagina- ácido aspártico + NH4+

(2) α-cetoglutarato + NH4+ + NADPH + glutamato deshidrogenasa (catalizador) - glutamato + NADP+ + H2O.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la 50 determinación de la capacidad del paciente para responder (i) positivamente a tratamiento con esta forma de asparaginasa o (ii) no responder a él o (iii) solo responder incompletamente.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, que comprende, para los casos (ii) y (iii) , la decisión de tratar al paciente usando alguna otra asparaginasa. 55

13. El procedimiento según la reivindicación 11, que comprende, para el caso (i) , la decisión de tratar el paciente usando esta asparaginasa.

14. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que la otra asparaginasa es una asparaginasa

incluida en un biovector.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que la otra asparaginasa está encapsulada en eritrocitos.