Formulación y procedimiento para la prevención y el tratamiento de la manifestación esquelética de la enfermedad de Gaucher.

Formulación que comprende glucocerebrosidasa encapsulada en eritrocitos,

en la que los eritrocitosque encapsulan la glucocerebrosidasa se han sometido a tratamiento químico con una disolución debis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3) para así promover el direccionamiento de macrófagos y/o células de Gaucher enla médula ósea para su utilización en la prevención o tratamiento de manifestaciones esqueléticas de la enfermedadde Gaucher.

Formulación y procedimiento para la prevención y el tratamiento de la manifestación esquelética de la enfermedad de Gaucher

La invención se refiere a formulaciones y fármacos para su utilización en la prevención y tratamiento de la manifestación esquelética de la enfermedad de Gaucher.

La enfermedad de Gaucher es una enfermedad genética autosómica recesiva provocada por una deficiencia de una enzima lisosómica, la beta-glucocerebrosidasa. Es la enfermedad de almacenamiento lisosómico más habitual con una prevalencia de aproximadamente 1/100.000 entre la población general, pero parece ser más común entre la población judía asquenazí.

La enfermedad está causada por mutaciones en el gen de la beta-glucocerebrosidasa. Se han descrito más de 100 mutaciones de este gen con diferentes tasas de incidencia, lo que explica la gran heterogeneidad en su presentación clínica.

La beta-glucocerebrosidasa hidroliza la glucosilceramida para formar ceramida y glucosa. La glucosilceramida es un complejo glicolipídico procedente de la degradación de las membranas celulares de los glóbulos rojos y los linfocitos.

Debido a la deficiencia de beta-glucocerebrosidasa, la glucosilceramida sin degradar (o glucocerebrósido) se acumula en los lisosomas de macrófagos del sistema reticuloendotelial, principalmente en el hígado, el bazo y la médula ósea. Dichos macrófagos cargados con glucocerebrósido se denominan células de Gaucher. Dicha acumulación es la causa de las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad: hepatomegalia, esplenomegalia y complicaciones óseas. Si el hueso se encuentra afectado, esto se puede manifestar en deformaciones, osteopenia u osteonecrosis; el hueso se encuentra afectado en el 80% de los pacientes.

Hoy en día el tratamiento de la enfermedad de Gaucher se basa en dos estrategias terapéuticas separadas que están dirigidas a limitar el almacenamiento de glucosilceramida para así prevenir los efectos potencialmente mortales vinculados a su acumulación. La primera de estas estrategias es un tratamiento enzimático sustitutivo con imiglucerasa que es el tratamiento de referencia y se utiliza en primera instancia. La segunda, la terapia de reducción del sustrato con miglustat, es menos eficaz y presenta efectos secundarios más significativos. Así esta terapia está reservada para una indicación en el segundo caso, cuando ya no se tolera la imiglucerasa.

El objetivo del tratamiento mediante la captación de enzima exógena (imiglucerasa) es compensar la deficiencia de glucocerebrosidasa. Inicialmente extraída, hoy en día la enzima es recombinante y se produce en células CHO. También está modificada para así exponer los restos de manosa a sus cadenas de oligosacáridos y así ser reconocida por los receptores de manosa presentes en la superficie de los macrófagos.

El tratamiento se inicia a una dosificación de 120 UI/kg/mes mediante perfusiones de 60 UI/kg cada 15 días. En general la respuesta a la terapia enzimática es buena con una mejora de la hepato-esplenomegalia y de las anomalías hematológicas a los pocos meses. La reducción del volumen hepático es, de media, entre el 20 y el 30% después de 6 y 12 meses de tratamiento, respectivamente, y la regresión del volumen esplénico puede alcanzar el 50% después de 12 meses. La cantidad de hemoglobina se incrementa hasta 1, 5 g/dl a los seis meses y se normaliza en un año, doblándose el número de plaquetas en 12 meses (Germain DP, Pathologie Biologie, 2004; 52: 343-350) . A pesar de una buena tolerancia general, entre el 10 y el 15% de los pacientes desarrolla anticuerpos para la enzima y el 50% de estos pacientes presenta prurito o urticaria durante las perfusiones de la enzima.

A pesar de que la terapia de sustitución enzimática hace posible mejorar las anomalías hematológicas y la hepato-esplenomegalia en unos pocos meses, su eficacia está mucho más limitada con respecto a la corrección de las manifestaciones óseas de la enfermedad. El dolor óseo mitiga gradualmente después de 24 meses, pero la mejora objetiva en la manifestación esquelética, puesta de manifiesto por el incremento en la densidad mineral del hueso y una reducción en la infiltración medular, solo se observa después de 3 a 4 años de terapia (Poll LW y col., The British Journal of Radiology, 2002; Suppl. 1: A25-A36) . Un estudio publicado por Wenstrup y col. (Wenstrup y col., Journal of Bone and Mineral Research, 2007; 22: 119-126) que sintetiza los resultados obtenidos en el seguimiento durante ocho años de 502 pacientes (160 sin tratar y 342 tratados con la enzima) muestra que no se observó mejora en la densidad mineral del hueso después de 2 años de tratamiento. Se observó un incremento significativo en la densidad ósea después de 4 años y medio. No obstante, no se produce un retorno a una situación normal hasta después de 8 años de tratamiento.

La manifestación esquelética está entre las características más incapacitantes de la enfermedad de Gaucher. Los pacientes sufren dolores de huesos y, en algunos casos, crisis óseas. La proporción de pacientes 5 cuya movilidad se ve reducida es del 20%. Los exámenes radiológicos muestran deformidad ósea de tipo matraz Erlenmeyer, osteopenia ocasionalmente responsable de fracturas, osteonecrosis e infiltración de la médula ósea (Wenstrup RJ y col., The British Journal of Radiology, 2002; Suppl. I: A2-A12) . El impacto negativo de estas complicaciones sobre la calidad de vida del paciente es significativo. En consecuencia, existe una necesidad real de desarrollar nuevos procedimientos de tratamiento que permitan una mejor gestión de las manifestaciones esqueléticas de la enfermedad de Gaucher.

Los desarrollos se han basado en la encapsulación de la glucocerebrosidasa en eritrocitos con vistas a mejorar las propiedades farmacológicas de la enzima.

Ihler y col. (P.N.A.S. USA, 1973, 70, 9: 2663-2666) han demostrado que es posible encapsular enzimas con un elevado peso molecular (beta-glucosidasa y beta-galactosidasa) en eritrocitos por medio de un proceso de lisisresellado. Los autores creen que la beta-glucocerebrosidasa también se podría encapsular en eritrocitos para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. También se puede realizar la degradación de la membrana de dichos eritrocitos en vistas a dirigir los macrófagos al bazo.

En Prog Clin Biol Res. 1982; 95: 655-667, Ihler revisa los estudios relativos a la encapsulación de glucocerebrosidasa en eritrocitos. El autor recuerda que la glucocerebrosidasa libre tiene una semi-vida in vitro de entre 1 y 3 horas a 37 °C y que, estabilizada con l a adición de DTT (ditiotreitol) o BSA (seroalbúmina bovina) , su semi-vida se incrementa hasta entre 12 y 13 horas. La encapsulación en eritrocitos incrementa la semi-vida in vitro de la enzima hasta entre 15 y 20 horas. La semi-vida de la enzima encapsulada en los eritrocitos se incrementa hasta las 400 horas en presencia de glucosa. El autor sugiere que la encapsulación de la enzima puede protegerla hasta que se introduzca en las células de Gaucher y que esta introducción podría tener lugar mediante eritrofagocitosis. Recuerda que la eritrofagocitosis se puede activar mediante diferentes técnicas, tales como el tratamiento con neuraminidasa, tratamiento térmico, unión de anticuerpos, y tratamiento por medio de reactivos que reaccionan con sulfhidrilo. El autor también muestra que el tratamiento de los glóbulos rojos con glutaraldehído hace posible promover su eliminación por los macrófagos del bazo o del hígado, dependiendo de la concentración de glutaraldehído (Tabla 5) . Este autor escribe en un momento muy anterior a la aplicación clínica, que aún es muy incierta y no aborda el direccionamiento de la médula ósea.

Otro equipo sometió clínicamente a ensayo la utilización de una suspensión de glóbulos rojos que encapsulan glucocerebrosidasa (Beutler E y col., P.N.A.S. USA, 1977, 74, 10: 4620-4623) . Un paciente en estadios avanzados de la enfermedad de Gaucher se sometió a 5 ciclos de tratamiento alternando la administración de glucocerebrosidasa libre y glucocerebrosidasa encapsulada en eritrocitos durante un periodo de 11 meses. La observación clínica del paciente reveló una ligera reducción en el tamaño del hígado así como una reducción en los niveles de glucosilceramida en las células sanguíneas. El paciente finalmente murió. No se ha informado de ningún beneficio clínico del tratamiento.

Más recientemente, Bax y col. llevaron a cabo experimentos orientados a optimizar los parámetros de encapsulación de la glucocerebrosidasa (Bax BE y col. Biochem Soc Trans. 1996; 24 (3) : 441 S) . Al año siguiente, el

mismo equipo público los resultados de un estudio piloto... [Seguir leyendo]

1. Formulación que comprende glucocerebrosidasa encapsulada en eritrocitos, en la que los eritrocitos que encapsulan la glucocerebrosidasa se han sometido a tratamiento químico con una disolución de bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) para así promover el direccionamiento de macrófagos y/o células de Gaucher en la médula ósea para su utilización en la prevención o tratamiento de manifestaciones esqueléticas de la enfermedad de Gaucher.

2. Formulación para su utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la suspensión de eritrocitos que encapsula la glucocerebrosidasa se pone en contacto con BS3 durante entre 10 minutos y 1 hora, en particular durante entre 15 minutos y 45 minutos, preferentemente durante entre 20 y 40 minutos, y normalmente durante 30 minutos aproximadamente.

3. Formulación para su utilización de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, 15 en la que la incubación con BS3 es a temperatura ambiente.

4. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en la que antes de la incubación con BS3, la suspensión de eritrocitos que incorpora la glucocerebrosidasa se lava con un tampón adecuado, preferentemente con PBS.

5. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la suspensión de eritrocitos que encapsula la glucocerebrosidasa se lleva hasta una concentración de entre 0, 5 × 106 y 5 × 106 células/µl, preferentemente entre 1 × 106 y 3 × 106 células/µl, antes de ponerse en contacto con la disolución de BS3.

6. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la disolución de BS3 se utiliza para obtener una concentración final de BS3 de entre 0, 1 y 6 mM, preferentemente entre 0, 5 y 3 mM, incluso más preferentemente de 1 mM aproximadamente en la suspensión.

7. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que se utiliza una disolución tamponada de BS3 que tiene una osmolaridad entre 280 y 320 mOsm y un pH entre 7, 2 y 7, 6, preferentemente de 7, 4.

8. Formulación para su utilización de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la disolución de BS3 35 comprende glucosa y tampón fosfato.

9. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la cantidad de enzima encapsulada está entre 1 y 50 UI de enzima por ml de eritrocitos a un hematocrito del 100%.

10. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la suspensión se acondiciona en una bolsa de sangre que contiene entre 10 y 10.000 UI de glucocerebrosidasa, en particular entre 200 y 5000 UI.

11. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su 45 uso para prevenir la manifestación esquelética de la enfermedad de Gaucher en pacientes que aún no hayan desarrollado una manifestación de este tipo.

12. Formulación para su utilización de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en pacientes sanos que, no obstante, es probable que desarrollen la enfermedad de Gaucher. 50

13. Formulación para su utilización de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en pacientes que sufren la enfermedad de Gaucher sin una manifestación esquelética real o detectable.

14. Formulación para su utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para el

tratamiento de la manifestación esquelética de la enfermedad de Gaucher en pacientes que hayan desarrollado dicha manifestación.