Provisión de nuevas células progenitoras de cardiomiocitos y cardiomiocitos derivados de éstas.

Una fracción celular que comprende al menos 90% de células progenitoras de cardiomiocitos humanos (CMPCs) que se caracterizan por un epítopo Sca-1 y CD31 en su superficie celular.

Provisión de nuevas células progenitoras de cardiomiocitos y cardiomiocitos derivados de estas

La presente invención se relaciona con las células progenitoras de cardiomiocitos (CMPCs), preferentemente las CMPCs humanas (hCMPCs). Se proporcionan además los métodos para el aislamiento de tales células. La presente invención se relaciona además con el uso de las CMPCs para la provisión de cardiomiocitos, por medio de la diferenciación de las CMPCs obtenidas con un agente de desmetilación. Se proporcionan además composiciones farmacéuticas que comprenden las CMPCs para uso en una terapia de reemplazo de cardiomiocitos y/o para el tratamiento del infarto de miocardio o para mejorar los efectos del infarto de miocardio. Estas composiciones se pueden usar en terapias de reemplazo de cardiomiocitos y/o para el tratamiento del infarto de miocardio o para mejorar los efectos del infarto de miocardio. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de las CMP obtenibles mediante los métodos de la invención en métodos de selección, por ejemplo, métodos de selección de fármacos.

Si no se define de cualquier otra forma, los términos usados en la presente descripción tienen el significado y el alcance que tienen generalmente en la técnica pertinente de la medicina o la bioquímica, particularmente en el campo de la cardiología, inmunología, biología celular, electrofisiología y biología molecular.

El infarto de miocardio es un trastorno cardiovascular grave común y la causa principal de la insuficiencia cardiaca y muerte cardíaca. La pobre perfusión tisular y la función defectuosa de los cardiomiocitos son mecanismos fundamentales para el desarrollo de la disfunción del miocardio, y la incapacidad de los cardiomiocitos remanentes para regenerar y compensar la pérdida de masa celular ventricular. Las células madre se han estudiado intensamente como fuente de nuevos cardiomiocitos para mejorar el miocardio lesionado y mejorar la función cardíaca 1'4. Se investigó el beneficio potencial terapéutico del trasplante de células madre en los modelos animales usando las células de la médula ósea 5'7, las células madre cardíacas , las células madre embrionarias (ES) 9,1 y cardiomiocitos fetales 11,12 inyectados en el sitio de la lesión cardiaca. Los resultados reportados en los estudios animales ha permitido ya la iniciación de varios ensayos clínicos aunque en la actualidad sólo se han evaluado en ensayos clínicos el uso de células derivadas de la médula ósea y mioblastos esqueléticos 13"16. La plasticidad del desarrollo de las células de la médula ósea de diferenciarse en cardiomiocitos se ha cuestionado 1718 y el efecto predominante in vivo de las células de la médula ósea o progenitoras endoteliales puede ser neoangiogénesis pero no la regeneración muscular. El trasplante autólogo de mioblastos esqueléticos se confunde con la inducción de arritmias potencialmente mortales a pesar de la integración parcial, supervivencia y contribución a la contractilidad cardíaca. Otra fuente de cardiomiocitos trasplantares son los cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias humanas (hES). Aunque las células hES se pueden dirigir en el linaje de los cardiomiocitos, con un fenotipo fetal19, la diferenciación no es homogénea a pesar de las mejoras recientes en los protocolos 2,21. Además, los problemas inmunogénicos, arritmogénicos y éticos limitarán su uso clínico.

Por consiguiente, el problema técnico fundamental en la presente invención fue la provisión de medios y métodos para las terapias de reemplazo de cardiomiocitos.

Este problema técnico se resuelve mediante la provisión de las modalidades como caracterizadas en las reivindicaciones.

Recientemente, se identificaron en el corazón diferentes poblaciones de células madre cardíacas 2, es decir, células que expresan el receptor del factor de células madre (c-Kit 8), antígeno-1 de células madre (Sca-1 22), o factor de transcripción homeodominio (islote-1 23) en su superficie celular, células de la población colateral (SP 24) y células capaces de crecer en las cardioesferas.

Aunque poblaciones de células cardíacas de roedores demostraron ser capaces de la diferenciación en cardiomiocitos, ya sea in vitro o in vivo, hasta la fecha no existe ninguna evidencia indiscutible, de que cualquiera de las poblaciones de células madre cardíacas humanas son capaces de diferenciarse en cardiomiocitos funcionales maduros. Hasta el momento las diferentes poblaciones de células madre cardiacas humanas aisladas, in vitro sólo se diferencian en cardiomiocitos cuando se co-cultivan con cardiomiocitos neonatales.

Se aislaron las células progenitoras de los cardiomiocitos humanos (hCMPCs) a partir del tejido de corazón humano usando un anticuerpo anti-Sca-1 (Goumans y otros, 25. Circulation 112: U16), aunque se debatió de un determinante genuino de Sca-1 en las células humanas. Las células se seleccionaron usando un anticuerpo Sca-1, tanto de corazón humano fetal como adulto que resultaron susceptibles a la expansión en el cultivo. La población de células progenitoras aislada del corazón humano se definió como inmunofenotípicamente distinta de las células madre y progenitoras cardíacas descritas previamente (revisado en 1'3). Lo más destacado en nuestro estudio fue el aislamiento y cultivo de las hCMPCs a partir de biopsias del atrio de pacientes adultos sometidos a cirugía cardíaca, particularmente, injerto de derivación de arteria coronaria (CABG). La alta frecuencia inesperada con la que esto fue

posible abre perspectivas, por ejemplo, para el trasplante autólogo posterior a la fecha de la cirugía inicial si los cultivos se llevaron a cabo en condiciones clínicamente compatibles.

Varios grupos aislaron poblaciones de células del corazón de los roedores y ser humano 8,22`25y todas estas poblaciones derivadas de células madre cardiacas son distintas de las CMPCs descritas en la presente, basado en su origen (es decir, la parte del corazón a partir de la que se aislaron), su perfil de expresión génica, su perfil de expresión de marcadores de superficie celular y sus características de crecimiento. Diferencias significativas se resumen parcialmente en la siguiente Tabla 2 y se explican además más abajo en la presente descripción.

Tabla 2

	CMPC de la invención	c-kit	lsl-1	Sca-1 (ratón)
Expresión del marcador	Sca-1 +/c-kit+/-/CD31 +	Sca-1 +/c-kit+/CD31-	Sca-1 -/c-kit-/CD31 -	Sca-1 +/c- kit-/CD31-
	Nkx2.5+/Gata4+/Mef2c +/(antes de la diferenciación)	Nkx2.5+/Gata4+/Mef2c+ (sólo cuando de cultiva en medio dif.)	Nkx2.5+/Gata4+	Nkx2.5-
	Isl1 +	Isl1-	Isl1 +
	CD34-/CD45-	CD34-/CD45-	ND
Aislamiento	Expresión de Sca-1	Expresión de C-kit	co-cultivo con fobroblastos cardiacos resulta en la formación de I si 1 + agregados	Expresión de Sca-1
Crecimiento	células adherentes cuando se cultivan sobre placa recubierta con gelatina	fracción no-adherente recubierta	co-cultivo con fibroblastos cardíacos
	Aurícula del corazón;
Ubicación	Atrio en corazón adulto humano, atrio en corazón fetal, límite AV y dentro del ventrículo	Ventrículo humano	corazón humano postnatal, atrio ventrículo y OFT	Corazón de ratón

Una diferencia aparente que se puede observar entre las células descritas en la técnica y las células aisladas (CMPCs) subyacente en la presente invención es la expresión del epítopo Sca-1, (un término que se explicará más abajo en la presente descripción) y CD31 en la superficie celular.

La presente invención, generalmente se refiere así, a las células progenitoras de cardiomiocitos aislados (CMPCs) que se caracterizan por el epítopo Sca-1 y CD31 en su superficie celular. "Aislado" se refiere al material extraído de su medio ambiente original, y se altera así de su estado natural "por la mano del hombre".

Además, se proporciona la primera evidencia... [Seguir leyendo]

1. Una fracción celular que comprende al menos 9% de células progenitoras de cardiomiocitos humanos (CMPCs) que se caracterizan por un epítopo Sca-1 y CD31 en su superficie celular.

2. Un método in vitro para el enriquecimiento de células progenitoras de cardiomiocitos humanos (CMPCs), que comprende las etapas de:

(a) disociar el tejido del corazón, por ejemplo, derivado del atrio; y

(b) enriquecer las CMPCs con un agente de unión a Sca-1 y un agente de unión a CD31.

3. Una fracción de células que comprende las CMPCs de acuerdo con la reivindicación 1, que se obtiene por un método de la reivindicación 2.

4. Una fracción celular que comprende las CMPCs de acuerdo con la reivindicación 1, dichas células son capaces de la diferenciación en cardiomiocitos in vitro después del tratamiento con 5-azacitidina o 5-aza-2'desoxicitidina en presencia de ácido ascórbico.

5. Un método in vitro para la diferenciación de las CMPCs humanos en los cardiomiocitos, preferentemente en ausencia de cardiomiocitos neonatales co-cultivados, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una fracción celular que comprende las CMPCs de acuerdo con la reivindicación 1; y

(b) tratar dichas CMPCs con un agente de desmetilación.

(c) permitir diferenciarse en cardiomiocitos las CMPCs así tratadas.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho agente de desmetilación es 5-azacitidina o 5-aza-2'-desoxicitidina.

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde dicha fracción celular que comprende las CMPCs se trata con dicho agente de desmetilación en presencia de un agente antioxidante, preferentemente ácido ascórbico.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que comprende además la etapa de:

(b1) tratar las CMPCs con un miembro de la familia de TGF-p.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho miembro de la familia TGF-p es TGF-p.

1. Una composición farmacéutica que comprende la fracción celular de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Una fracción celular de acuerdo con la reivindicación 1, para el uso en una terapia de reemplazo de cardiomiocito

y/o en un método para el tratamiento de infarto de miocardio o para mejorar los efectos del infarto de miocardio.

12. Una fracción celular para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la terapia de reemplazo de cardiomiocitos es la mejora de la fuerza contráctil cardiaca.

13. Uso de una fracción de células de acuerdo con la reivindicación 1, para los métodos de selección, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar dicha fracción celular que comprende células progenitoras de cardiomiocitos (CMPCs);

(b) poner dichas CMPCs en contacto con una sustancia de prueba; y

(c) evaluar el efecto de dicha sustancia de prueba sobre la capacidad de diferenciación de dichas CMPCs.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho método de selección es un método de selección de

fármacos.