Proteína específica de células beta pancreáticas de los islotes de Langerhans y sus aplicaciones.

Uso de un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo seleccionado del grupo que consiste en los péptidos de secuencia SEQ ID Nos:

7, 8, 9 y 10, para detectar y/o seleccionar islotes de Langerhans y/o células beta de los islotes de Langerhans, a partir de una muestra de páncreas humano o animal.

Proteína específica de células beta pancreáticas de los islotes de Langerhans y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a una proteína llamada ZnT-8, expresada de forma específica en las células beta pancreáticas de los islotes de Langerhans, a los polinucleótidos que codifican dicha proteína que está implicada en la maduración y exocitosis de la insulina, así como a sus aplicaciones, en particular para la selección y estudio de células beta, así como para el cribado de medicamentos activos para la diabetes y la hiperinsulinemia.

La diabetes es una de las enfermedades más frecuentes, que afecta a 5% de la población de países industrializados y está en constante aumento en todos los países del mundo (previsión: 300 millones en 2025, de los cuales 2, 4 millones en Francia) . Entre las diversas formas de la diabetes, la diabetes de tipo I o insulinodependiente afecta a aproximadamente 500.000 a 1 millón de individuos en Estados Unidos y a 150.000 en Francia, es decir de 0, 2 a 0, 4 % de la población. Los síntomas característicos comprenden una tasa elevada de azúcar en la sangre y en la orina, diuresis importante, hambre y sed intensos, así como pérdida de peso.

La diabetes de tipo II no insulinodependiente (DNID) , descrita también con el nombre de diabetes “grasa” o diabetes de la madurez, aparece con frecuencia alrededor de los 50 años. Se trata mediante régimen, toma de medicamentos por vía oral, e insulina después de algunos años de evolución. Hoy en día, 2 millones de franceses son tratados con medicamentos antidiabéticos y/o insulina.

Aunque la diabetes pueda estar controlada por inyecciones de insulina y aportes controlados de glúcidos, las complicaciones asociadas con esta patología hoy en día necesitan nuevos procedimientos para su prevención, tratamiento y diagnóstico.

El páncreas comprende dos estructuras tanto morfológica como fisiológicamente distintas:

- el páncreas exocrino que produce las enzimas que intervienen en la digestión (amilasa, lipasa, etc.) y bicarbonato sódico;

- el páncreas endocrino que produce las hormonas que intervienen en el control de la glucosa sanguínea (insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático) .

Las células del páncreas endocrino están organizadas en microórganos dispersos en el páncreas en forma de islotes (islotes de Langerhans o islotes pancreáticos) . Cada islote pancreático está compuestos de 4 tipos de células: células alfa, beta, delta y células PP. Las células alfa están situadas en la periferia del islote y secretan glucagón. Las células beta se encuentran en el centro del islote y son las únicas células capaces de secretar insulina en respuesta a la glucosa. Las células delta están en la periferia y secretan somatostatina. La función de las células PP es más controvertida (síntesis del polipéptido pancreático) .

La ausencia de modelo celular de estudio de la célula beta, así como la ausencia de un medio fiable y eficaz de selección celular adaptado a este tipo de célula, frena el estudio de su funcionamiento y por lo tanto el desarrollo de nuevos procedimientos de tratamiento de la diabetes de tipo I y II.

Entre los tratamientos de la diabetes, además de la administración regular de insulina, una de las vías de control fisiológico de la glucemia y la normalización de la glucemia en los diabéticos, es el paso por la restauración de la secreción de insulina in vivo a partir de las células. En esta óptica se han propuesto varias soluciones:

- la obtención de células productoras de insulina en animales mediante la realización de un xenotrasplante;

- la diferenciación in vitro de células secretoras de insulina a partir de células madre aisladas, con el propósito de reimplantación [1], esto con el fin de salvar los problemas de inmunidad y la necesidad de un tratamiento inmunosupresor del paciente. Pero la producción de cantidades importantes de células con bajo coste, productoras de insulina por diferenciación de células madre, necesita nuevas herramientas biomoleculares, en particular útiles para el fenotipado y la purificación de las células diferenciadas;

- el trasplante de islotes pancreáticos; recientemente numerosos trabajos han tenido como objetivo la preparaciones de islotes o de células beta pancreáticas con fines terapéuticos. La primera etapa del trasplante es la extracción del páncreas de un donante en estado de muerte cerebral. El aislamiento de los islotes empieza por una digestión enzimática del páncreas mediante una disolución de colagenasa. Todos los trasplantes no requieren una purificación de los islotes digeridos. Sin embargo, la mayoría de los investigadores hoy están de acuerdo en decir que la purificación de los islotes es necesaria para un alotrasplante [2]. Después los islotes son trasplantados, a razón de una masa suficiente (mínimo 3000 IEQ/kg) por inyección intraportal (IEQ: islote equivalente, Equivalent Ilôt) .

Sin embargo, el aislamiento de islotes o de células beta pancreáticas necesita medios de selección e identificación de las células beta, específicos y fiables.

Trabajos anteriores han intentado desarrollar procedimientos de marcaje de células beta. Se pueden citar:

- el marcaje por la GFP (proteína verde fluorescente) que permite un marcaje fluorescente de la célula. El inconveniente principal de esta técnica es la necesidad de introducir un gen exógeno o transgén en la célula, y lo que es más, el uso de un vector vírico (adenovirus) [1];

- la técnica basada en la autofluorescencia importante de la célula beta [2]. Pero esta técnica carece de especificidad frente al tipo celular;

- la incubación de células con un fluorocromo específico de cinc: Newport Green [3] o ditizona [4]. Esta técnica se basa en el contenido importante de cinc en la célula beta. El cinc es un constituyente importante de los gránulos de secreción de insulina, y además, tiene una función en el control de esta secreción [5]. Pero estas técnicas presentan muchos inconvenientes: uso de un producto químico, riesgo de toxicidad frente a la célula beta, carece de especificidad frente al tipo celular. Además, la ditizona tiene un problema de fotodegradación rápida [6];

- poner de manifiesto de forma indirecta por reconocimiento por un clon de linfocitos T (documento WO 91/17186) la presencia de un antígeno expresado por las células beta. Los trabajos iniciales sobre este antígeno no aportaron resultados en términos de caracterización de la secuencia peptídica, así como en términos de la selectividad de la célula beta en relación con los otros tipos de células del islote, y también del páncreas o del organismo. Trabajos más recientes de los mismos autores, muestran una distribución mucho mayor de este antígeno, que, de hecho, no es específico de la célula beta [7];

- la detección del transportador de glucosa GLUT-2 [15]; pero este transportador no es específicos de las células beta.

Por consiguiente, existe una falta de marcador específico y fiable de las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans.

Uno de los objetivos del presente estudio es proporcionar dicho marcador.

El islote de Langerhans acumula cantidades muy grandes de cinc y por lo tanto necesita un transportador muy eficaz y muy especializado para acumular este cinc en las vesículas de secreción [8]. La insulina, producida y almacenada en las células beta pancreáticas, es liberada en el medio extracelular por exocitosis en respuesta a estímulos externos, como un aumento de la concentración de glucosa. Esta elevación de glucosa produce una modificación de la relación de ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio y la abertura de los canales de calcio, lo que provoca la exocitosis [9].

Se sabe que en presencia de cinc, la insulina puede formar tetrámeros y hexámeros que fijan el cinc con una relación de insulina:cinc de 4:1 y 6:2, respectivamente. La insulina es almacenada en los gránulos de secreción en forma de un sólido compuesto de hexámeros ligados a 2 átomos de cinc por hexámero. Las vesículas contienen cinc en un exceso de 1 a 1, 5 veces la cantidad necesaria para formar los hexámeros de insulina-cinc. Durante la exocitosis de la insulina, las vesículas ricas en insulina se fusionan con la membrana plasmática de la célula beta y liberan la insulina y también el cinc, a la circulación. El cinc liberado actúa en un bucle de retrocontrol negativo en los canales de potasio, provocando su activación y la detención de la exocitosis.

En las células de mamífero, se han clonado y caracterizado 7 proteínas homólogas que tienen una función... [Seguir leyendo]

1. Uso de un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo seleccionado del grupo que consiste en los péptidos de secuencia SEQ ID Nos: 7, 8, 9 y 10, para detectar y/o seleccionar islotes de Langerhans y/o células beta de los islotes de Langerhans, a partir de una muestra de páncreas humano o animal.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico,

anticuerpo humanizado o un fragmento Fab o F (ab’) 2.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque dicho anticuerpo está marcado.

4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho anticuerpo está contenido en un chip de proteínas.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra de páncreas animal procede de un animal seleccionado de ratones, ratas, conejos y cerdos.

6. Procedimiento de selección de células beta de los islotes de Langerhans, que comprende una primera etapa de poner en contacto las células de una muestra biológica que puede contener dichos islotes y/o células, con un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo seleccionado del grupo que consiste en los péptidos de secuencia SEQ ID Nos: 7, 8, 9 y 10, una segunda etapa de detección de las células marcadas por el anticuerpo y una tercera etapa de aislar las células marcadas.

7. Uso de un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo seleccionado del grupo que consiste en los péptidos de secuencia SEQ ID Nos: 7, 8, 9 y 10, para seguir el proceso de diferenciación de las células madre en células beta de los islotes de Langerhans.

8. Procedimiento para seguir el proceso de diferenciación de células madre en células del islote pancreático o en células beta, que comprende una etapa de poner en contacto células de una muestra biológica que puede contener dichas células madre que se están diferenciando, con un anticuerpo que reconoce específicamente un epítopo seleccionado del grupo que consiste en los péptidos de secuencia SEQ ID Nos: 7, 8, 9 y 10, una segunda etapa de poner de manifiesto las células marcadas por el anticuerpo y una tercera etapa de visualizar las células marcadas.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, o procedimiento según la reivindicación 6 o la reivindicación 8, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un fragmento Fab o F (ab’) 2.

10. Uso o procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque dicho anticuerpo está marcado.

11. Uso o procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque dicho anticuerpo está contenido en un chip de proteínas.