Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras.

Célula huésped que puede expresar más de un POI (polipéptido de interés),

comprendiendo la célula huésped una proteína de fusión o un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión,

comprendiendo dicha proteína de fusión dichos POI y

i. un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, en el que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta;

ii. un dominio translocador de una proteína autotransportadora; y

iii. un péptido señal que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gramnegativas;

en la que el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos dominios laterales, y

en la que al menos dos POI se insertan en, reemplazan o reemplazan parcialmente un dominio lateral separado.

Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras

Campo técnico La presente invención se refiere en general a una proteína de fusión novedosa y a un método para la expresión de proteínas secretoras.

Antecedentes de la técnica La expresión de proteínas secretoras es la expresión de una proteína en una célula huésped, en la que la proteína se exporta a la membrana celular y o bien se libera de manera soluble al medio o bien permanece unida a la membrana celular. La expresión de proteínas secretoras está mediada por un péptido señal en el extremo N-terminal

de la proteína que dirige el polipéptido a la membrana.

Habitualmente, las proteínas recombinantes que se producen en huéspedes procariotas tales como E. coli se producen de manera intracelular. Cuando la proteína se recupera en un procedimiento de este tipo, las células tienen que lisarse lo que conduce a la contaminación de la proteína recombinante con el contenido celular. La proteína tiene que recuperarse entonces de extractos de células completas en procedimientos de purificación de múltiples etapas, lo que requiere mucho tiempo y da como resultado escasos rendimientos.

La secreción de proteínas recombinantes al medio es una mejor estrategia porque la purificación de proteínas a partir de medio gastado es más fácil y más compatible con el cultivo continuo. Sin embargo, los presentes sistemas no tienen rendimientos eficaces.

La expresión de proteínas secretoras en la que la proteína permanece unida a la superficie celular tiene otros usos. Los ejemplos de uso para este tipo de expresión de proteínas incluyen el desarrollo de vacunas vivas, mapeo de epítopos, desarrollo de biosensores y biosorbentes y la selección de alto rendimiento de bibliotecas de proteínas y péptidos para el descubrimiento de fármacos.

Tanto en la presentación en superficie como en la secreción, las proteínas recombinantes se enfrentan al desafío de la translocación a través de la compleja envuelta de la célula E. coli que consiste en dos membranas lipídicas (la membrana interna y externa) con un compartimento similar a gel, el periplasma, entremedias. Se ha mostrado que esto es muy difícil y los métodos usados previamente han tenido una baja eficacia.

Los autotransportadores son proteínas grandes que se secretan por bacterias Gram-negativas, tales como E. coli. El sistema de autotransportador es sencillo en el sentido de que el autotransportador, tal como implica su nombre, se sugiere que porta toda la información para la translocación a través del periplasma y la membrana externa dentro de la propia proteína. Sin embargo, el mecanismo mediante el cual se secretan los autotransportadores no se entiende todavía completamente.

Los autotransportadores se sintetizan como proteínas precursoras grandes que contienen tres dominios principales:

(i) un péptido señal N-terminal que dirige la proteína al translocón Sec e inicia la transferencia a través de la 45 membrana interna, (ii) un dominio pasajero que comprende la proteína de “cargamento” que va a secretarse y (iii) un dominio de formación de poros C-terminal (dominio translocador) que comprende una estructura de barril beta que se integra en la membrana externa y desempeña un papel crucial pero poco claro en la translocación del dominio pasajero a través de la membrana externa al espacio extracelular.

Tras la translocación, el dominio pasajero se escinde del dominio translocador y se libera al entorno extracelular. En algunos casos, el dominio pasajero permanece unido de manera no covalente a la superficie celular. La escisión puede lograrse mediante la acción de una proteasa (externa) en un motivo de proteasa situado entre el dominio translocador y el dominio pasajero. Alternativamente, la escisión tiene lugar a través de un acontecimiento autocatalítico intramolecular en un sitio específico entre el dominio translocador y el dominio pasajero.

El dominio pasajero de un autotransportador comprende una estructura de tallo beta y dominios laterales. El tallo beta es una estructura alargada formada por una hélice beta extendida. El extremo C-terminal del dominio pasajero comprende un dominio autochaperona que se ha implicado tanto en el plegado del pasajero como en la translocación a través de la membrana externa.

Hbp es una proteína autotransportadora que pertenece a la subfamilia de autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae (SPATE) . La estructura cristalina del dominio pasajero de Hbp se ha determinado recientemente (Otto et al. 2005 J Biol Chem 280 (17) : 17339-45) y se muestra como figura 11A. La estructura muestra que el polipéptido forma una estructura de hélice beta larga en el sentido de las agujas del reloj (“tallo beta”) . El dominio 65 pasajero de la Hbp comprende dos dominios laterales más grandes, el dominio d1 y el dominio d2, de los cuales d1 comprende la actividad serina proteinasa de la proteína y d2 tiene una función desconocida. Hay también tres

dominios laterales más pequeños, el dominio 3 (d3) , dominio 4 (d4) y dominio 5 (d5) .

Se han mostrado también dominios de tallo beta similares para otros autotransportadores tales como pertactina (Emsley et al 1996 Nature 381: 90-92) e IgA proteasa (Johnson et al 2009 J Mol Biol 389 (3) : 559-74) .

Ha habido intentos previos en el uso de autotransportadores para la expresión de proteínas secretoras en E. coli, principalmente usando variantes de la IgA proteasa de Neisseria (Pyo et al 2009 Vaccine 27 2030-2036) y el autotransportador de E. coli endógeno AIDA-I (Van Gerven et al 2009 Microbiology 155:468-476) que se modificaron por ingeniería genética para fines de presentación en superficie.

Los esfuerzos en el uso de IgA proteasa y AIDA-I para la secreción de proteínas recombinantes usaron constructos que dieron como resultado escasos rendimientos de proteína secretada y expuesta en la superficie (Pyo et al 2009 Vaccine 27 2030-2036; Van Gerven et al 2009 Microbiology 155:468-476) . En la mayoría de tales estudios el dominio pasajero completo, o casi completo, endógeno se reemplazó por la proteína recombinante.

Hasta la fecha, los autotransportadores se han usado principalmente como plataforma de presentación en vez de para la secreción de proteínas heterólogas en forma soluble, cuando la proteína se secreta al medio.

La IgA proteasa requiere una proteasa auxiliar para el procesamiento mientras que AIDA-1 permanece unidad de manera no covalente a la membrana externa tras la escisión. Por tanto, estos autotransportadores sólo pueden usarse para la presentación en superficie de epítopos y proteínas.

Se ha mostrado previamente la secreción y presentación eficaces de calmodulina fusionada al pasajero de Hbp (Jong et al 2007 Molecular Microbiology 63:1524-1536) . Con el fin de minimizar la perturbación del tallo β nativo del

pasajero, la calmodulina reemplazó al dominio 2 del pasajero de Hbp.

Konieczky et al., FEMS immunology and medical microbiology, vol. 27, nº 4, 1 de abril de 2000 () , páginas 321-332, describen la presentación en la superficie celular de (poli) péptidos recombinantes incluyendo epítopos de células T funcionales mediante el sistema de autotransportador de AIDA.

El documento WO 02/070645 A2 (MAX PLANCK GESELLSCHAFT [DE]; JOSE JOACHIM [DE]; HANNEMANN FRANCK [DE]) 12 de septiembre de 2002 () da a conocer la presentación de polipéptidos funcionales recombinantes sobre la superficie de una célula huésped usando el dominio de transporte de un autotransportador.

Jose J et al., microbiology and molecular biology reviews, American Society for Microbiology, EE.UU., resumen las características estructurales básicas del sistema de autopresentación de Escherichia coli y proporciona ejemplos para su aplicación satisfactoria en la presentación de enzimas, biocatálisis de células completas, presentación de inhibidores y examen de bibliotecas de diseño y desarrollo de vacunas vivas.

Jong W S et al., Current Opinion in Biotechnology, Londres, RU, dan a conocer el progreso reciente en el análisis estructural y mecanístico de la ruta de autotransportador de Escherichia coli y las implicaciones para el desarrollo futuro de una plataforma versátil para la secreción y presentación de proteínas heterólogas.

Para determinadas aplicaciones la posibilidad de secretar o presentar más de una proteína de interés (POI) a partir

de/sobre la superficie celular es muy útil. Tales aplicaciones incluyen vacunas, por ejemplo en las que dos o más epítopos se presentan sobre la misma superficie celular, presentación de enzimas, en la que más de una enzima... [Seguir leyendo]

1. Célula huésped que puede expresar más de un POI (polipéptido de interés) , comprendiendo la célula huésped una proteína de fusión o un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión dichos POI y

i. un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, en el que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta;

ii. un dominio translocador de una proteína autotransportadora; y

iii. un péptido señal que puede dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gramnegativas;

en la que el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos dominios laterales, y

en la que al menos dos POI se insertan en, reemplazan o reemplazan parcialmente un dominio lateral separado.

2. Célula huésped según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión, cuando se expresa, se presenta en la superficie celular.

3. Célula huésped según las reivindicaciones 1-2, en la que la proteína de fusión, cuando se expresa, se secreta y se libera desde la superficie celular.

4. Proteína de fusión que comprende

i. más de un POI (polipéptido de interés)

ii. un dominio pasajero que comprende un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora, en el que la secuencia que forma tallo beta del dominio pasajero está esencialmente intacta;

iii. un dominio translocador de una proteína autotransportadora; y

iv. opcionalmente, un péptido señal que dirige la proteína de fusión a la membrana interna de una bacteria Gram-negativa,

en la que el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos dominios laterales, y

en la que al menos dos POI reemplazan o reemplazan parcialmente un dominio lateral separado.

5. Célula huésped según las reivindicaciones 1-3 o proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que el dominio pasajero en i) y el dominio translocador en ii) se derivan de una proteína SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae) .

6. Ã?cido nucleico dispuesto para la expresión de una proteína de fusión, comprendiendo dicho ácido nucleico, en marco:

i. una secuencia que codifica para un péptido señal de dicha proteína de fusión, pudiendo el péptido señal dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas;

ii. una secuencia que codifica para un dominio pasajero de dicha proteína de fusión, comprendiendo el dominio pasajero un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora; y

iii. una secuencia que codifica para un dominio translocador de dicha proteína de fusión, derivándose el dominio translocador de una proteína autotransportadora,

en el que la secuencia que codifica para el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales que sobresalen del dominio de tallo beta, y en el que la secuencia que codifica para el dominio pasajero comprende al menos dos tramos de secuencia de sitio de clonación que permiten la clonación en marco de al menos dos secuencias de ADN que codifican para POI (polipéptidos de interés) , dichos al menos dos tramos de secuencia de sitio de clonación insertándose en, reemplazando o reemplazando parcialmente tramos separados de dichos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales y estando dichos tramos de secuencias de sitio de clonación dispuestos de tal manera que la secuencia de proteína que forma tallo beta codificada del dominio pasajero está esencialmente intacta.

7. Ã?cido nucleico dispuesto para la expresión de una proteína de fusión, comprendiendo dicho ácido nucleico, en marco:

i. una secuencia que codifica para un péptido señal de dicha proteína de fusión, pudiendo el péptido señal dirigir la proteína de fusión a la membrana interna de bacterias Gram-negativas;

ii. una secuencia que codifica para un dominio pasajero de dicha proteína de fusión, comprendiendo el dominio pasajero un dominio de tallo beta de una proteína autotransportadora;

iii. una secuencia que codifica para un dominio translocador de dicha proteína de fusión, derivándose el dominio translocador de una proteína autotransportadora; y

iv. secuencias que codifican para más de un POI (polipéptido de interés) de dicha proteína de fusión,

en el que las secuencias que codifican para los POI están fusionadas con la secuencia que codifica para el dominio pasajero y están dispuestas de tal manera que la secuencia de proteína que forma tallo beta codificada del dominio pasajero está esencialmente intacta, y en el que la secuencia que codifica para el dominio pasajero del autotransportador en su forma nativa comprende al menos dos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales que sobresalen del dominio de tallo beta, y cada una de las secuencias que codifican para POI se insertan en, reemplazan o reemplazan parcialmente tramos separados de dichos tramos de secuencia que codifican para dominios laterales.

8. Ã?cido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que las secuencias que codifican para el dominio pasajero en ii) y el dominio translocador en iii) se derivan de un gen que codifica para una proteína SPATE (autotransportadores de serina proteasa de Enterobacteriaceae) .

9. Vector que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

10. Célula huésped que comprende un ácido nucleico o vector según cualquiera de las reivindicaciones 6-9.

11. Célula huésped según las reivindicaciones 1-3, 5 y 10, que es una bacteria Gram-negativa.

12. Vesícula de membrana externa que presenta una proteína de fusión según la reivindicación 4 ó 5 sobre su superficie.

13. Fantasma bacteriano que presenta una proteína de fusión según la reivindicación 4 ó 5 sobre su superficie.

14. Método para la expresión de proteínas secretoras de una proteína de fusión, que comprende las etapas de

i. proporcionar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5 ó 10;

ii. inducir la expresión de la proteína de fusión.

15. Método según la reivindicación 14, que comprende la etapa adicional de inhibir una enzima periplásmica con actividad proteasa en la célula huésped.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-15, que comprende la etapa adicional de regular por disminución al menos una enzima que cataliza la formación de enlaces disulfuro en proteínas en el espacio periplásmico de la célula huésped.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que la proteína de fusión se secreta de manera soluble.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en el que la proteína de fusión se presenta sobre la superficie celular.

19. Célula huésped según las reivindicaciones 1-3, 5 ó 10, proteína de fusión según las reivindicaciones 4-5, ácido nucleico según las reivindicaciones 6-8, vector según la reivindicación 9, vesícula de membrana externa según la reivindicación 12, fantasma bacteriano según la reivindicación 13, en donde al menos uno de los POI comprende un antígeno, por ejemplo de un organismo infeccioso, por ejemplo un antígeno de Mycobacterium tuberculosis.

20. Método según las reivindicaciones 14-18, en el que al menos uno de los POI comprende un antígeno, por

ejemplo de un organismo infeccioso, por ejemplo un antígeno de Mycobacterium tuberculosis.

21. Vacuna que comprende una célula huésped, una proteína de fusión, una vesícula de membrana externa o un fantasma bacteriano según la reivindicación 19.