Proteína de fusión anticancerígena.

Una proteína de fusión que comprende:

un dominio (a) que es el fragmento funcional de la secuencia de la proteína hTRAIL soluble,

en donde dicho fragmento funcional es capaz de inducir una señal apoptótica y comienza con un aminoácido en una posición no inferior a hTRAIL95 o una secuencia que tiene al menos 70% de homología con la misma; y

un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector proapoptótico, que efectúa su acción proapoptótica a través de la ruta intrínseca de la apoptosis, en donde la secuencia del dominio (b) se fija en el extremo Cterminal y/o N-terminal del dominio (a).

Proteína de fusión anticancerígena

La invención se refiere al campo de las proteínas de fusión terapéuticas, en particular a proteínas de fusión recombinantes. Más particularmente, la invención se refiere a proteínas de fusión que contienen el fragmento de una secuencia de la proteína soluble humana TRAIL, en combinación con la secuencia de un péptido proapoptótico corto, y a composiciones farmacéuticas que las contienen que tienen uso en terapia, en particular como agentes anticancerígenos.

La apoptosis (muerte celular programada) es un proceso que tiene un papel importante en la prevención del cáncer y en el tratamiento del cáncer mediante el uso de agentes que inducen la apoptosis de células cancerígenas anormales.

La señalización de la apoptosis se puede iniciar desde fuera de una célula (ruta extrínseca o ruta de receptores de muerte) o desde el interior de una célula (ruta intrínseca o mitocondrial).

La activación de las rutas extrínsecas de la apoptosis en células cancerígenas humanas requiere la unión de un ligando a los receptores de muerte celulares para activar los receptores. Después de la unión de un ligando, los receptores activados inducen señales de apoptosis.

La iniciación de la apoptosis intrínseca dentro de una célula a través de la ruta mitocondrial puede comenzar en diferentes niveles de la cascada apoptótica, para causar finalmente la inducción o el restablecimiento de funciones de proteínas proapoptogénicas (citocromo c, SmacDiablo, AIF, p53, proteínas de la familia Bcl2 que incluyen la familia del dominio BH3), la degradación de ácidos nucleicos o la activación de caspasas.

La proteína TRAIL que pertenece a la familia de las citocinas (ligando inductor de la apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral, del inglés Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Inducing Ligand), también conocida como Apo2L (ligando de Apo2), es un potente activador de la apoptosis en células tumorales y en células infectadas por virus. TRAIL es un ligando de origen natural en el organismo. La proteína TRAIL, su secuencia de aminoácidos, las secuencias que codifican el ADN y los sistemas de expresión de proteínas se describieron por primera vez en el documento EP83535A1.

La proteína TRAIL ejerce su actividad anticancerígena uniéndose a los receptores de superficie proapoptóticos 1 y 2 de TRAIL (TRAIL-R1/R2) y activando posteriormente estos receptores. Estos receptores, también conocidos como DR4 y DR5 (receptor de muerte 4 y receptor de muerte 5), pertenecen a la familia de receptores de TNF y se hiper- expresan en diferentes tipos de células cancerígenas. La activación de los receptores puede Inducir la ruta de señalización externa de la apoptosis, independiente del gen supresor p53 que, con la caspasa-8 activada, conduce a la activación de las caspasas efectoras y de ese modo se produce la degradación de los ácidos nucleicos. La caspasa- 8 liberada después de la activación con TRAIL, también puede causar la liberación de la proteína Bid y activar de este modo de forma indirecta la ruta mitocondrial, en donde la proteína Bid se trasloca a la mitocondria, y allí estimula la liberación de citocromo c, amplificando así indirectamente la señal apoptótica de los receptores de muerte.

TRAIL actúa selectivamente sobre las células tumorales, esencialmente sin inducir la apoptosis en las células sanas, que son resistentes a esta proteína. Por lo tanto, el enorme potencial de TRAIL ha sido reconocido como agente anticancerígeno que actúa sobre una amplia gama de diferentes tipos de células tumorales, incluyendo neoplasias hematológicas y tumores sólidos, y al mismo tiempo sin influir en las células normales y ejerciendo efectos secundarios que son potencialmente relativamente irrelevantes.

La proteína TRAIL es una proteína de membrana de tipo II que tiene una longitud de 281 aminoácidos y su región extracelular, que comprende los residuos de aminoácidos 114-281 después de la escisión con proteasas, forma la molécula sTRAIL soluble de 2 kDa de tamaño que también es biológicamente activa. Ambas formas TRAIL y sTRAIL son capaces de desencadenar la apoptosis a través de la interacción con receptores de TRAIL presentes en las células diana. Se ha demostrado una actividad antitumoral fuerte y muy baja toxicidad sistémica de la parte soluble de la molécula de TRAIL mediante pruebas con líneas celulares. Además, estudios clínicos en humanos con TRAIL humana recombinante soluble (rhTRAIL) que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 114-281 de hTRAIL, conocida con el INN dulanermina, mostraron su buena tolerancia y la ausencia de toxicidad limitante de la dosis.

Estudios recientes muestran que la proteína TRAIL puede tener una forma más corta que los aminoácidos 114-281, y que también en esa forma es capaz de unirse a los receptores de membrana de la familia DR (receptores de muerte, DR1, DR2, DcR1, DcR2 y OPG) e inducir la ruta de la apoptosis a través de estos receptores (F., FANG, A., WANG, S.,F., YANG, Antitumor activity of a novel recombinant mutant human tumor necrosis factor-related apopto- sis-inducing ligand, Acta Pharmacologica Sínica 25 Nov; 26 (11): 1373-1381).

Los efectos tóxicos de la proteína TRAIL recombinante sobre células hepáticas descritos en la actualidad parece que están asociados con la presencia de una modificación, es decir, marcadores de polihistidina, TRAIL sin marcar no muestra toxicidad sistémica.

Sin embargo, en el curso de una investigación y el desarrollo posterior, parece que muchas células cancerígenas también muestran resistencia primaria o adquirida a TRAIL (véase, por ejemplo el documento W27/2221). Aunque el mecanismo de resistencia a TRAIL no se entiende completamente, se cree que se puede manifestar en diferentes niveles de la ruta de la apoptosis inducida por TRAIL, que se extienden desde el nivel de receptores en la superficie celular, a las caspasas efectoras dentro de la ruta de señalización. Esta resistencia limita la utilidad de TRAIL como agente anticancerígeno.

Además, en ensayos clínicos con pacientes, se mostró que la eficacia real de TRAIL como monoterapia era baja. Para superar esta eficacia baja y la resistencia de tumores a TRAIL, se han diseñado diversas terapias combinadas con agentes radioterapéuticos y quimioterapéuticos, lo que dio como resultado un efecto apoptótico sinérgico. (Documento W29/2947; A. Almasan y A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (23) 337-348; RK Sri- vastava, Neoplasis, vol. 3, n° 6, 21, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, vol. 28, n° 9 (21), págs. 1527- 1533). El uso de rhTRAIL para el tratamiento del cáncer en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales, seleccionados (paclitaxel, carboplatino) y anticuerpos monoclonales anti-VEGF, se describe en el documento W29/14469. Sin embargo, una combinación de este tipo implica necesariamente insuficiencias bien conocidas en la quimioterapia o radioterapia convencional.

Una proteína de fusión artificial que contiene secuencias de una vasostatina inhibidora de la angiogénesis y TRAIL unida con un enlazador con sitio de escisión para la metaloproteasa, ha sido descrita por tener un efecto inductor de la apoptosis en células tumorales, por A.l. Guo et al en Chínese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 28, vol. 24(1), 925-93.

En la proteína de fusión artificial que contiene las secuencias tumstatinal 83-23 de una tumstatina inhibidora de la angiogénesis y TRAIL114-281, se ha descrito que muestra una inducción de la apoptosis de células de cáncer pancreático, en N. Ren et al en Academic Journal of Second Military Medical University 28, vol. 28(5), 676-478.

El documento US25/24437 y el documento correspondiente W24/35794 dan a conocer la estructura artificial de TRAIL95-281 como un dominio efector unido por un enlazador peptídico con la parte extracelular de otro miembro de la familia TNF de ligandos CD4, como un dominio que se une a la superficie celular. Se indica que la activación de la estructura artificial es a través de la unión de su parte CD4.

El documento WO21/551 D7 describe una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de TRAIL y un polipéptido que se une a TWEAK, específicamente a Fn14 soluble, que es un receptor cognado de TWEAK. La proteína de fusión tiene actividad destructora frente a células cancerígenas debido a la unión del dominio TRAIL a sus receptores de muerte de la membrana. El dominio Fn14 de la proteína de fusión, debido a la actividad de unión a TWEAK, bloquea el eje celular Fn14/TWEAK y produce efectos celulares de TWEAK, que incluyen sus efectos protumorígenos y proapoptóticos, que dependen de la... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión que comprende:

un dominio (a) que es el fragmento funcional de la secuencia de la proteína hTRAIL soluble, en donde dicho fragmento funcional es capaz de Inducir una señal apoptótica y comienza con un aminoácido en una posición no inferior a hTRAIL95 o una secuencia que tiene al menos 7% de homología con la misma; y

un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector proapoptótico, que efectúa su acción proapoptótica a través de la ruta Intrínseca de la apoptosls, en donde la secuencia del dominio (b) se fija en el extremo C- termlnal y/o N-term¡nal del dominio (a).

2. La protelna de fusión según la reivindicación 1, en la que el dominio (a) es el fragmento de la secuencia de

la proteína hTRAIL soluble, cuyo fragmento comienza con un aminoácido dentro del Intervalo hTRAIL95 a

hTRAIL121, Inclusive, y termina con el aminoácido hTRAIL281.

3. La protelna de fusión según la reivindicación 1 o 2, en la que el dominio (a) se selecciona entre el grupo que consiste en hTRAIL114-281 (SEQ. No. 27), hTRAIL119-281 (SEQ. No. 28), hTRAIL121-281 (SEQ. No. 29), hTRAIL116-281 y hTRAILI2-281.

4. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el dominio (a) es la secuencia hTRAIL95-281.

5. La proteína de fusión según las reivindicaciones 1 a 4, en la que el dominio (b) se selecciona entre el grupo

constituido por:

- el fragmento del dominio BH3 de la proteína Bax de SEQ. No. 3;

- el fragmento de la proteína Bid de SEQ. No. 31;

- ribonucleasa A de SEQ. No. 32;

- citocromo C de SEQ. No. 33;

- granzima B de SEQ. No. 34;

- el fragmento de la proteína Nur77 de SEQ. No. 35;

- dominio BH3 de la proteína Bak de SEQ. No. 36;

- dominio BH3 de la proteína PUMA/BBC3 de SEQ. No. 37;

- proteína PUMA/BBC3 de SEQ. No.38;

- el fragmento de la proteína SMAC/Diablo de SEQ. No. 39;

- buforina A de SEQ. No. 4;

- onconasa de SEQ. No. 41;

- el fragmento de la proteína Mdm2 de SEQ. No. 42;

- la unión peptídica a Mdm2 de SEQ. No. 43;

- un fragmento de lunaslna de SEQ. No. 44;

- dominio BH3 de la proteína Bik de SEQ. No. 45;

- el péptido inhibidor de proteasoma de SEQ. No. 46;

- el dominio que comprende los motivos UIM de unión a proteasoma de SEQ. No. 47;

- el péptido obtenido a partir de azurina de SEQ. No. 151;

- el péptido de azurina de longitud completa de SEQ. No. 152;

- el péptido diseñado a partir de la protelna aPP y el dominio BH3 de la proteína Bax de SEQ. No. 153;

- el péptido diseñado a partir de la proteína aPP y el dominio BH3 de la proteína Bax de SEQ. No. 154;

- el péptido obtenido a partir de Reticulón RTN1-C de SEQ. No. 155;

- el Reticulón 3 humano de longitud completa de SEQ. No. 156;

- la caspasa-3 activa modificada constitutivamente de SEQ. No. 157;

- el dominio SAC procedente de la proteína Par-4 de SEQ. No. 158;

- proteína Noxa de SEQ. No. 159;

- fragmento MTD/CKP de la proteína Noxa de SEQ. No. 16;

- el péptido híbrido corto Antp-TPR de SEQ. No. 161;

- el inhibidor peptídico del dominio SH2 de la proteína Stat3 de SEQ. No. 162;

- el péptido obtenido a partir del dominio BH3 de la proteína Bak de SEQ. No. 163;

- el péptido obtenido a partir del dominio BH3 de la proteína Bad de SEQ. No. 164; y

- el péptido ATAP de la proteína Bfl1 de SEQ. No. 165.

6. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que entre el dominio (a) y el dominio (b) contiene un dominio (c) que comprende un sitio de escisión para proteasas reconocido por las proteasas presentes en el entorno de las células tumorales, seleccionado a partir de una secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP, una secuencia reconocida por la urocinasa uPA, una secuencia reconocida por la furina y combinaciones de las mismas.

7. La proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que la secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP es SEQ. No. 51, SEQ. No. 171 o SEQ. No. 173, la secuencia reconocida por la urocinasa uPA es SEQ. No. 52, y la secuencia reconocida por la furina es SEQ. No. 53 o SEQ. No. 172.

8. La proteína de fusión según las reivindicaciones 6 o 7, en la que el dominio (c) es una combinación de secuencias reconocidas por la metaloproteasa MMP y la urocinasa uPA situadas una al lado de la otra.

9. La proteína de fusión según las reivindicaciones 6 o 7, en la que el dominio (c) es una secuencia reconocida por furina.

1. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio (b) está enlazado adicionalmente con un dominio de transporte (d), seleccionado a partir del grupo que consiste en:

- (d1) secuencia que se dirige al retículo endoplásmico,

- (d2) secuencia de poliarginina que transporta a través de la membrana celular, que comprende 6, 7, 8 o 9 residuos de Arg,

- (d3) dominio de traslocación de Pseudomonas aeruginosa seleccionado a partir de SEQ. No. 54 o SEQ. No.

176;

- (d4) dominio de transporte a través de la membrana,

- (d5) dominio de localización nuclear, y

- (d6) dominio de direccionamiento mitocondrial, y sus combinaciones.

11. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un dominio (e) de un enlazador estérico flexible de glicina-serina entre los dominios (a), (b), (c) y/o (d).

12. La proteína de fusión según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ. No. 1; SEQ. No. 2; SEQ. No. 3; SEQ. No. 4; SEQ. No. 5; SEQ. No. 6; SEQ. No. 7; SEQ. No. 8; SEQ. No. 9; SEQ. No. 1; SEQ. No. 11; SEQ. No. 12; SEQ. No. 13; SEQ. No. 14; SEQ. No. 15; SEQ. No. 16; SEQ. No. 17; SEQ. No. 18; SEQ. No. 19; SEQ. No. 2; SEQ. No. 21; SEQ. No. 22; SEQ. No. 23; SEQ. No. 24; SEQ. No. 25, SEQ. No. 26, SEQ. No. 93, SEQ. No. 94, SEQ. No. 95, SEQ. No. 96, SEQ. No. 97, SEQ. No. 98, SEQ. No. 99, SEQ. No. 1, SEQ. No. 11, SEQ. No. 12, SEQ. No. 13, SEQ. No. 14, SEQ. No. 15, SEQ. No. 16, SEQ. No. 17, SEQ. No. 18, SEQ. No. 19, SEQ. No. 11, SEQ. No. 111, SEQ. No. 112, SEQ. No. 113, SEQ. No. 114, SEQ. No 115, SEQ. No. 116, SEQ. No. 117, SEQ. No. 118, SEQ. No. 119, SEQ. No. 12ySEQ. No. 121.

13. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene adicionalmente como su parte C-terminal la secuencia hTRAIL95-121, precedida por la secuencia del sitio de escisión de proteasas que permite su escisión de la estructura artificial.

14. Una composición farmacéutica, que comprende como ingrediente activo la proteína de fusión tal como se

ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una proteína de fusión tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso en un método de tratamiento de enfermedades cancerígenas en mamíferos, incluyendo seres humanos.