Procedimiento de producción de oligosacáridos sialilados.

Procedimiento para la producción de oligosacáridos que comprenden al menos un resto de ácido siálico,

a los que se hace referencia en la presente memoria como oligosacáridos sialilados, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo en un medio de cultivo, que comprende opcionalmente un precursor exógeno, en el que dicho microorganismo comprende genes heterólogos que codifican una CMP-Neu5Ac sintetasa, una ácido siálico sintasa, una GlcNAc-6-fosfato 2-epimerasa y una sialiltransferasa, y en el que los genes endógenos que codifican la ácido siálico aldolasa (NanA) y la ManNac cinasa (NanK) se han suprimido o inactivado, pudiendo dicho microorganismo producir ácido siálico activado internamente.

Procedimiento de producción de oligosacáridos sialilados.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis in vivo a gran escala de oligosacáridos sialilados, al cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo, que comprende opcionalmente un precursor exógeno tal como la lactosa, en el que dicho microorganismo comprende unos genes heterólogos que codifican una CMP-Neu5Ac sintetasa, una ácido siálico sintasa, una GlcNAc-6-fosfato 2-epimerasa y una sialiltransferasa, y en el que los genes endógenos que codifican la ácido siálico aldolasa (NanA) y ManNAc cinasa (NanK) se han suprimido o inactivado. La invención se refiere asimismo a este microorganismo que puede producir ácido siálico activado internamente.

Antecedentes de la invención El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) es el miembro más corriente de la familia del ácido siálico de aminoazúcares. El Neu5Ac se encuentra con frecuencia como un azúcar terminal en los hidratos de carbono complejos de la superficie celular y ejerce una función importante en muchos procesos biológicos tales como la adhesión celular y la unión de las toxinas y los virus de la (Varki, 1993) . El Neu5Ac es también un componente importante de la fracción de hidrocarbonatada de los gangliósidos que son especialmente abundantes en el tejido cerebral y están involucrados en varias patologías (Zhang y Kiechle, 2004) .

En razón de sus importantes funciones biológicas, los oligosacáridos que contienen ácido siálico han atraído considerable interés y se han desarrollado muchos procedimientos para sintetizar estas estructuras para la investigación fundamental y potenciales aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, la producción a gran escala de oligosacáridos sialilados no se ha conseguido hasta la actualidad.

Las síntesis químicas no son prácticas debido a las múltiples etapas de protección y desprotección y se han dedicado muchos esfuerzos a los procedimientos enzimáticos y biotecnológicos. Las sialiltransferasas utilizan CMP-Neu5Ac como azúcar-nucleótido activado y el desarrollo de procesos eficientes para las síntesis enzimáticas de sialiloligosacáridos ha sido posible mediante la identificación de los genes de sialiltransferasa bacteriana que están bien expresados en E. coli y el diseño de múltiples sistemas enzimáticos que imitan la ruta natural de la biosíntesis de azúcar-nucleótidos (Gilbert et al., 1998) .

Una mejora significativa se produjo a partir de la utilización de células bacterianas vivas para producir sialiloligosacáridos (Priem et al., 2002) . En este enfoque, se produjo directamente sialil-lactosa cultivando células de cepas de Escherichia coli metabólicamente modificadas que sobreexpresan los genes de Neisseria meningitidis para la a-2, 3-sialiltransferasa y para CMP-Neu5Ac sintasa. Las bacterias se cultivaron a alta densidad celular con glicerol como fuente de carbono y energía, mientras que se suministraron lactosa exógena y Neu5Ac como precursores para la síntesis de sialil-lactosa. Durante el cultivo, la lactosa y Neu5Ac fueron interiorizadas activamente por ºgalactósido de E. coli y Neu5Ac permeasas. Para evitar el catabolismo de la lactosa y de Neu5Ac, se utilizaron cepas mutantes desprovistas de actividades de º-galactosidasa y Neu5Ac aldolasa. La lactosa y Neu5Ac acumuladas en el citoplasma donde Neu5Ac se convirtió después en CMP-Neu5Ac para ser transferido a continuación a la lactosa para formar sialil-lactosa (patente europea EP 1194584 de los inventores) . Este sistema se aplicó a la producción del fragmento carbohidratado de los gangliósidos GM2 y GM1 mediante la expresión adicional de los genes de glucosiltransferasa apropiados (Antoine et al., 2003) . Los oligosacáridos polisialilados (azúcares de GD3 y GT3) también se produjeron por este procedimiento y con el gen cstll de Campylobacter que codifica una a2, 3- y a-2, 8-sialiltransferasa bifuncional (solicitud US 60/690.837 de los inventores y Antoine et al., 2005) .

La producción a gran escala de sialiloligosacáridos por este procedimiento microbiológico requiere cantidad importante de ácido siálico como precursor. El ácido siálico se puede purificar de fuentes naturales tales como la leche y la yema de huevo, pero los rendimientos son bajos y el procedimiento no es adecuado para producción a gran escala. El ácido siálico se prepara generalmente por síntesis enzimática mediante la ácido siálico aldolasa utilizando N-acetilmanosamina (ManNAc) y piruvato como sustrato. Para reducir el coste, se prepara normalmente ManNAc por epimerización química o enzimática de N-acetilglucosamina, que es un sustrato más económico que ManNAc (Lee et al., 2004;. Maru et al., 1998.) . A pesar de estas mejoras, el coste de ácido siálico todavía es relativamente alto y este coste obstaculiza el desarrollo de un sistema económico para la producción de sialiloligosacáridos.

Antoine et al. (Chembiochem., vol. 4, nº 5, 9 de mayo de 2003, págs. 406-412) y Priem et al. (Glycobiology, vol. 12, nº 4, oct. 2002, págs. 235-240) describen la producción de azúcares sialilados de lactosa y Neu5Ac como precursores externos. La patente EP 1 484 406 describe la producción de Neu5Ac en E. coli que sobreexpresa la GlcNAc-2-epimerasa y la Neu5Ac sintasa.

Hamamoto Tomoki et al. (Biotechnology and Biochemistr y oct. 2005, vol. 69, nº 10, págs 1944-1950) dan a conocer

la síntesis enzimática de CMP-Neu5Ac a partir de GlcNAc y CMP utilizando E. Coli que comprende una GlcNAc 6-P 2-epimerasa heteróloga y una NeuAc sintasa heteróloga en combinación con células de levadura y CMP-NeuAc sintetasa de H. influenza purificada.

El documento WO 2005/090552 se refiere a la producción de glucoproteínas sialiladas en levaduras y Ends et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, Spriger Verlag, Berlín, vol. 53, nº 3, marzo de 2000, páginas 257-261) describe la producción de sialiloligosacáridos por combinación de dos cepas diferentes de E. coli.

También, cepas similares a K1 de E. coli y N. meningitidis son capaces de producir CMP-Neu5Ac, pero son patógenas y no se pueden utilizar en procesos biotecnológicos por razones de seguridad. La mayoría de las demás bacterias, como por ejemplo K12 de E. coli, no tienen la organización enzimática para la biosíntesis de CMP-Neu5Ac, y es un objetivo de la invención modificar genéticamente las cepas no patógenas que serían capaces de producir CMP-Neu5Ac a partir de UDP-GlcNAc endógena.

En relación con la presente invención, se ha diseñado un nuevo sistema microbiano para la producción rentable a gran escala de sialiloligosacáridos sin necesidad de un suministro exógeno de ácido siálico. Los microorganismos modificados metabólicamente de la invención son viables, no patógenos y se pueden utilizar en procesos de cultivo a gran escala e industriales. Han optimizado rutas modificadas y la supresión de los ciclos metabólicos inútiles y han conducido a la biosíntesis de CMP-Neu5Ac activada que actúa como donante de ácido siálico in situ para formar oligosacáridos sialilados.

Breve sumario de la invención La presente invención proporciona un procedimiento de producción de oligosacáridos sialilados por cultivo fermentativo de microorganismos. En particular, la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de oligosacáridos portadores de uno o varios resto (s) de ácido siálico, sin adición de ácido siálico exógeno al medio de cultivo, que comprenden de manera no limitativa:

-restos de oligosacáridos de los gangliósidos seleccionados de entre

GM3 (3'sialil-lactosa, Neu5Aca-3Gal -4Glc) y oligosacáridos que comprende el motivo GM3,

GD3 Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -4Glc,

GT3 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -4Glc) ;

GM2 GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc,

GM1 Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal - 4Glc,

GD1a Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc

GT1a Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc

GD2 GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GT2 GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GD1b, Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GT1b Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GQ1b Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal - 3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GT1c Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GQ1c Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GP1c Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc

GD1a Neu5Aca-3Gal -3 (Neu5Aca-6) GalNAc -4Gal -4Glc

Fucosil-GM1 Fuca-2Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc;

que se en su totalidad se pueden extender a la producción de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de oligosacáridos que comprenden al menos un resto de ácido siálico, a los que se hace referencia en la presente memoria como oligosacáridos sialilados, que comprende la etapa de cultivar un microorganismo en un medio de cultivo, que comprende opcionalmente un precursor exógeno, en el que dicho microorganismo comprende genes heterólogos que codifican una CMP-Neu5Ac sintetasa, una ácido siálico sintasa, una GlcNAc-6-fosfato 2-epimerasa y una sialiltransferasa, y en el que los genes endógenos que codifican la ácido siálico aldolasa (NanA) y la ManNac cinasa (NanK) se han suprimido o inactivado, pudiendo dicho microorganismo producir ácido siálico activado internamente.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen heterólogo de sialiltransferasa se selecciona de entre a2, 3-sialiltransferasa, a-2, 3- y a-2, 8-sialiltransferasa (cstll) , y a-2, 6-sialiltransferasa.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el gen heterólogo de CMP-Neu5Ac sintetasa es neuA, el gen heterólogo de ácido siálico sintasa es neuB y el gen heterólogo GlcNAc-6-fosfato 2-epimerasa es neuC.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que los genes neuA, neuB y neuC se aíslan de cepas bacterianas que contienen la estructura sialilada en sus membranas celulares, tales como la cepa de C. jejuni nº de registro 43438 de la ATCC.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los genes nanT, NanA, NanK y nanE se suprimen o inactivan.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho microorganismo codifica además una proteína que facilita la absorción de lactosa y carece de enzimas que metabolizan la lactosa.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho microorganismo es una cepa de E. coli, que es LacY+, LacZ- y opcionalmente MelA-.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el precursor exógeno se selecciona de entre lactosa, galactosa, -galactósido y a-galactósido, tal como globotriosa (Gala-4Gal -4Glc) .

9. Microorganismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Medio de cultivo celular que comprende lactosa como precursor y el microorganismo de la reivindicación 9.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, para la producción de 3'sialil-lactosa o 6'sialil-lactosa, en el que el microorganismo se cultiva a una alta densidad celular en un sustrato de carbono, tal como glucosa o glicerol, y se alimenta con lactosa que está interiorizada por la lactosa permeasa y sialilada por dicha sialiltransferasa recombinante utilizando el CMP-Neu5Ac endógenamente generado a partir de UDP-GlcNAc.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de GD3, en el que el gen heterólogo de sialiltransferasa es una a-2, 3 y a-2, 8 sialiltransferasa bifuncional, tal como el gen cstll de Campylobacter jejuni depositado en la ATCC con nº de registro 43438, que cataliza la transferencia de un resto sialilo o de una molécula de ácido siálico activado producida internamente a la Neu5Aca-3Gal -4Glc (GM3) para formar Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -4Glc (GD3) .

13. Procedimiento según la reivindicación 12, que se extiende a la producción de GT3, en el que el microorganismo se cultiva además de tal manera que la sialiltransferasa bifuncional cataliza la transferencia de un resto sialilo de una molécula activada de ácido siálico producido internamente del Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -4Glc (GD3) para formar Neu5Ac5a-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -4Glc (GT3) .

14. Procedimiento según la reivindicación 11, que se extiende a la producción de la parte de hidratos de carbono del gangliósido Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc (GM1) , en el que el microorganismo comprende además secuencias heterólogas que codifican -1, 4GalNActransferasa y -1, 3-galactosiltransferasa, transfiriendo dicha 1, 4GalNActransferasa un resto UDP-GalNac a sialil-lactosa (GM3) para formar GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc (GM2) y la -1, 3-galactosiltransferasa transfiere un resto galactosil a GM2 para formar GM1.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el microorganismo comprende además una secuencia heteróloga que codifica una UDP-GlcNAc 4-epimerasa, tal como el gen wbpP de P. aeruginosa o el gen gne de C. jejuni.

16. Procedimiento según la reivindicación 11, que se extiende a la producción de Neu5Aca-3Gal -3GalNAc 4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc (GD1a) y Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca -3) Gal -4Glc (GA1) .

17. Procedimiento según la reivindicación 14 o 15, para la producción específica de GM1, en el que la sialil

transferasa heteróloga es una a-2, 3 sialiltransferasa codificada por el gen cstIII aislado de cepas de C. jejuni que expresan las estructuras de lipooligosacárido que imitan al gangliósido GM1, tal como la cepa de C. jejuni con nº de registro 11168 en la NCTC.

18. Procedimiento según la reivindicación 11, que se extiende a la producción de la parte de hidratos de carbono del gangliósido GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc (GM2) , en el que el microorganismo comprende además secuencias heterólogas que codifican una -1, 4-GalNActransferasa, tal como el gen CgtAII de la cepa de C. jejuni O:36 con nº de registro 43456 de la ATCC y una UDP-GlcNAc 4-epimerasa y en el que el microorganismo presenta por lo menos uno de los tres genes siguientes suprimidos o inactivados para interrumpir la producción endógena de UDP-Gal: el gen galE que codifica la UDP-glucosa epimerasa, el gen GalU que codifica la UDP-Glc pirofosforilasa y el gen pgm que codifica la fosfoglucomutasa.

19. Procedimiento según la reivindicación 11, que se extiende a la producción de la parte de hidratos de carbono del gangliósido de GD2 GalNAc -4Gal -4GlcNeu5Aca-8Neu5Aca3 en el que el microorganismo comprende además unas secuencias heterólogas que codifican UDP-GlcNAc 4-epimerasa y una -1, 4-GalNActransferasa que utilizan el azúcar de GD3 como aceptor, tal como la proteína CgtAII de la cepa de C. jejuni O:36 con el nº de registro 43456 de la ATCC.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, que se extiende a la producción de azúcar de GD1b (Gal -3GalNAc 4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-3) Gal -4Glc) y azúcar de GT1c (Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal 4Glc) en el que el microorganismo comprende además una secuencia heteróloga que codifica un gen de -3 Gal transferasa, tal como el gen cgtB de la cepa O:2 de C. jejuni con el nº de registro 11168 de la NCTC.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, que se extiende a la producción de GT1b (Neu5Aca-3Gal -3GalNAc 4 (Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc) , GQ1c (Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal 4Glc) , GQ1b (Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc) y GP1c (Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3) Gal -4Glc) en el que el microorganismo comprende además una secuencia heteróloga que codifica un gen que codifica una sialiltransferasa utilizando GD1b y GT1c como aceptor.

22. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el microorganismo presenta por lo menos uno de los tres genes siguientes suprimidos o inactivados para interrumpir la producción endógena de UDP-Gal: el gen galE que codifica la UDP-glucosa epimerasa, el gen galU que codifica la UDP-GIc pirofosforilasa, y el gen pgm.

23. Procedimiento según la reivindicación 11, que se extiende a la producción de la parte de hidratos de carbono del gangliósido de GT1b:

en el que el microorganismo comprende además unas secuencias heterólogas que codifican UDP-GlcNAc 4epimerasa, una -1, 4-GalNActransferasa que utilizan el azúcar de GD3 como aceptor, tales como la proteína CgtAII de la cepa O:36 de C. jejuni con el nº de registro 43456 en la ATCC y una -1, 3-galactosiltransferasa, tal como el gen cgtB de la cepa O:2 de C. jejuni con el nº de registro 11168 en la NCTC.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de Neu5Aca-3Gal -3GalNAc 4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc (GD1a) y Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -4 (Neu5Aca-3) Gal -4Glc (GT1a) , en el que el microorganismo comprende unas secuencias heterólogas que codifican una a-2, 3 a-2, 8-sialiltransferasa bifuncional, tal como el gen cstll de la cepa de C. jejuni con nº de registro 43438 en la ATCC, una -1, 4GalNAc transferasa, tal como el gen cgtAII de la cepa O:36 de C. jejuni con el nº de registro 43456 en la ATCC, que no utiliza el azúcar de GD3 como aceptor, y una -1, 3-galactosiltransferasa, tal como el gen cgtB de la cepa O:2 de C. jejuni con el nº de registro 11168 en la NCTC.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 para producir el pentasacárido LSTD (Neu5Aca-3Gal 4GlcNac -3Gal -4Glc) , en el que la sialil transferasa es una a-2, 3-sialil transferasa, tal como el gen nst, y en el que el microorganismo comprende además los genes heterólogos lgtA y lgtB que codifican -1, 3-GlcNAc transferasa y 1, 4-galactosiltransferasa respectivamente.

26. Procedimiento según la reivindicación 23 para la producción de oligosacáridos de sialil-lewis X, en el que el microorganismo comprende además una secuencia heteróloga que codifica una a-1, 3-fucosil-transferasa tal como futA de H. pylori (SEC. ID. nº 18) o futB (SEC. ID. nº 19) .

27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de sialosilgalactosil globósido (Neu5Aca-3Gal -3GalNAc -3Gala-4Gal -4Gal) , en el que el microorganismo se cultiva en un medio con globotriosa

y es LacY+, MelA-, nanT+, NanA-NanK- y comprende lgtD heterólogo, tal como el gen lgtD de HI1578 de Haemophilus influenzae, número de registro U32832 en Genbank, genes para la a-2, 3-sialiltransferasa y UGP-GlcNAc C4-epimerasa, así como los genes neuABC.

28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8 para la producción de sialilgalactosa (Neu5Aca-3 Gal) y oligosacáridos sialilados con una galactosa terminal reductora, en el que el microorganismo es galK-, NanA- y NanK- (o NanKEAT-) y expresa el gen de la sialiltransferasa y los genes neuBCA y se cultiva en un medio con galactosa.

29. Procedimiento según la reivindicación 1 para la producción de oligosacáridos sialilados con estructura de quito

oligosacárido en su extremo reductor, tal como el heptasacárido sialilado Neu5Aca-3Gal -4[GlcNAc -4]4GlcNAc, en el que la sialiltransferasa es una a-2, 3-sialiltransferasa tal como el gen nst de Neisseria y el microorganismo comprende además una quitin-oligosacárido sintasa tal como el gen nodC de Azorhizobium caulinodans y un gen de

-1, 4-galactosiltransferasa tal como el gen lgtB de Neisseria meningitidis.

30. Procedimiento según la reivindicación 29 para la producción del tetrasacárido sialilado Neu5Aca-3Gal 4GlcNAc -4GlcNAc, en el que el microorganismo comprende además una secuencia heteróloga que codifica una quitinasa, tal como el gen chiA.

31. Procedimiento según la reivindicación 29 o 30, en el que no se añade ningún precursor exógeno al medio de 20 cultivo.

32. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 31, en el que los microorganismos se están cultivando en glicerol o glucosa como sustrato de carbono.

33. Microorganismo tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12, 14, 15, 17 y 18 a 30.