Producción de mezclas oligoclonales de inmunoglobulinas en células individuales.

Un método para la producción de al menos dos proteínas exógenas en una célula huésped de mamífero o de levadura,

en el cual cada uno de los genes que codifican dichas proteínas está bajo el control de un promotor eucariota inducible distinto, dicho método comprende (a) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifica una primera proteína exógena, y, subsiguientemente, (b) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifica una segunda proteína exógena. donde cada una de dichas proteínas exógenas es una proteína multimérica heteromérica.

Producción de mezclas oligoclonales de inmunoglobulinas en células individuales Antecedentes de la invención Las mezclas de miembros de pares de unión oligoclonales y policlonales son herramientas valiosas en el tratamiento de enfermedades, especialmente las enfermedades infecciosas y el cáncer. Emplear una composición que contenga varios miembros de pares de unión que se unen a más de un epítopo puede aumentar la eficacia de las composiciones respectivas y disminuir, por ejemplo, el riesgo de escape de epítopos. Tales mezclas de inmunoglobulinas permiten además la administración dirigida a diferentes patógenos o subfamilias o subespecies específicas de un determinado patógeno o a una cierta población celular, especialmente en circunstancias en las que la generación de anticuerpos de reactividad cruzada no es posible o deseable.

Existen varias estrategias para la producción de miembros de pares de unión oligoclonales y policlonales, como las mezclas de anticuerpos. En su forma más sencilla cada anticuerpo se produce a partir de una línea celular diferente, es decir, cada anticuerpo se produce a partir de una única línea celular en recipientes de cultivo diferentes, generalmente fermentadores. En lo sucesivo, los anticuerpos individuales se mezclan más tarde para formar la mezcla de anticuerpos oligoclonales o policlonales. Véase el panel A en la figura 1. Como es evidente, este método requiere muchos recursos y por lo tanto no es comercialmente atractivo.

En otro método, cada anticuerpo sigue siendo producido a partir de una línea celular diferente, pero las líneas celulares se mezclan en un recipiente de cultivo, normalmente un fermentador. Este método tiene el defecto de que es esencialmente imposible controlar el crecimiento de diferentes líneas celulares en un fermentador, tornando la producción más o menos en un juego de azar. Estas cuestiones se complican aún más si se producen más de dos anticuerpos puesto que alguna línea celular podría ser capaz de multiplicarse más que otras, suprimiendo así la producción de algunas inmunoglobulinas de la mezcla. Véase por ejemplo WO2008/145133. Este método se describe en el panel B de la figura 1.

Aún en otro método, se producen dos o más anticuerpos en la misma línea celular, que con mayor razón tiene lugar en un recipiente de cultivo. La desventaja de este método proviene de la naturaleza heterodimérica de las inmunoglobulinas. La cadena pesada variable de un anticuerpo no sólo se apareará con su "propia" cadena ligera, sino que también indeseablemente con la cadena ligera variable del segundo (o cualquier otro subsiguiente) anticuerpo producido por la célula huésped. Esta situación se complica aún más si más de dos anticuerpos son producidos por dicha célula huésped. Los anticuerpos formados por cadenas de inmunoglobulinas apareadas incorrectamente pueden superar el número de anticuerpos formados correctamente, y por lo tanto, este método no es otra cosa que una solución inadecuada. Véase el panel C de la figura 1.

Por último, otro método utiliza cadenas ligeras comunes "falsas" (dummy) , (véase US 7, 429, 486) . En este método la especificidad del anticuerpo proviene de la cadena pesada variable; y la cadena ligera común a todos los anticuerpos producidos en este sistema es simplemente un medio para proporcionar una inmunoglobulina entera. Sin embargo, puesto que todos los anticuerpos necesitan ser funcionalmente activos, el uso de una cadena ligera común va acompañado de una reducción de los tipos y las propiedades de las inmunoglobulinas que se pueden producir. Además, la producción de una cadena pesada diferente no puede ser controlada adecuadamente, dando lugar a una mezcla de inmunoglobulinas más o menos sin caracterizar. Véase panel D en la figura 1.

En conjunto, no existe todavía una manera satisfactoria para producir eficazmente una mezcla policlonal u oligoclonal de inmunoglobulinas. Como resultará evidente, los métodos dados a conocer en la presente invención no son sólo aplicables a las inmunoglobulinas, sino a todas las proteínas multiméricas heteroméricas.

Resumen de la invención La presente invención permite por primera vez la producción eficaz y controlable de proteínas multiméricas, como las inmunoglobulinas, a partir de células huésped individuales, en un recipiente de cultivo. La presente invención proporciona un método que permite la separación de la producción de una proteína multimérica de la producción de cualquier cantidad de proteínas multiméricas adicionales. Puesto que la expresión de los genes que codifican las diferentes proteínas multiméricas puede ser separada temporalmente, en una realización preferida las subunidades de una proteína multimérica común se unirán entre sí sin unirse sustancialmente a una subunidad de una proteína multimérica diferente, formando así la proteína multimérica deseada. El apareamiento inadecuado de polipéptidos que conduce a la formación de proteínas multiméricas indeseadas e indeseables es por lo tanto eludido.

La presente invención proporciona un método para la producción de al menos dos proteínas exógenas en una célula huésped eucariota, en donde cada uno de los genes que codifican dichas proteínas está bajo el control de un promotor eucariota inducible distinto, donde el método comprende

(a) cultivar dicha célula huésped eucariota en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifica una primera proteína exógena, y,

(b) cultivar dicha célula huésped eucariota en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifica una

segunda proteína exógena. Los genes que codifican dichas primera y segunda proteínas exógenas se expresan de manera temporalmente separada, es decir, durante la expresión del gen que codifica dicha primera proteína exógena el gen que codifica dicha segunda proteína exógena no se expresa. Asimismo, durante la expresión del gen que codifica dicha segunda proteína exógena el gen que codifica dicha primera proteína exógena no se expresa. Dichas primera y segunda proteínas exógenas, así como cada una de todas las otras potenciales proteínas exógenas, pueden ser codificadas por genes del mismo vector o por genes de diferentes vectores. La célula huésped puede ser transinfectada con dicho vector o vectores de manera transitoria, o mediante transinfección estable, por ejemplo, mediante recombinación, tal como integración específica de sitio.

El concepto inventivo se ilustra en la figura 2. La presente invención es particularmente útil para la producción de proteínas multiméricas. Dichas proteínas multiméricas pueden ser proteínas que contengan al menos un sitio de unión al antígeno como las inmunoglobulinas.

La presente invención también proporciona células huésped y vectores para ser utilizados en los métodos dados a conocer en este documento. Además, la presente invención también proporciona mezclas de al menos dos proteínas exógenas que se pueden obtener por los métodos de la presente invención, así como el uso de dichas mezclas en tratamiento. La presente invención también proporciona recipientes de reacción, como fermentadores, para utilizar en los métodos de la presente invención. La presente invención también proporciona un kit que consiste en (a) una célula huésped que contiene los vectores según la presente invención, e (b) instrucciones para utilizar dichas células huésped según los métodos descritos en este documento.

Leyendas de las figuras La figura 1 ilustra los métodos disponibles en la actualidad para la producción de anticuerpos oligoclonales o policlonales. Como se describe en este documento, la presente invención es superior respecto a métodos similares conocidos en el estado anterior de la técnica. En aras de la simplicidad, la figura 1 muestra solamente un escenario en el cual se producen dos anticuerpos. La estructura trapezoidal indica un 35 recipiente de cultivo, como un matraz de cultivo. Los óvalos y los círculos indican células huésped. VH y VL indican que las células respectivas codifican y producen las respectivas cadenas pesada variable y ligera variable. Los números entre paréntesis pretenden diferenciar las distintas cadenas pesada variable y ligera variable producidas. Las primeras (1) cadenas pesada y ligera son representadas por líneas sólidas. Las segundas (2) cadenas pesada y ligera son representadas por líneas discontinuas o de puntos. Las diferentes estrategias se explican con más detalle en la sección de "Antecedentes" de este documento. La figura 2 ilustra la estrategia de la presente invención. Una célula huésped transformada con ambos genes VH y VL de la presente invención. Bajo ciertas condiciones de cultivo ("condición... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de al menos dos proteínas exógenas en una célula huésped de mamífero o de levadura, en el cual cada uno de los genes que codifican dichas proteínas está bajo el control de un promotor

eucariota inducible distinto, dicho método comprende

(a) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifica una primera proteína exógena, y, subsiguientemente,

(b) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifica una segunda proteína exógena.

donde cada una de dichas proteínas exógenas es una proteína multimérica heteromérica.

2. El método de la reivindicación 1, en el que durante la expresión de dicho gen que codifica la primera proteína exógena en el paso (a) , dicho gen que codifica la segunda proteína exógena no se expresa esencialmente.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que durante la expresión de dicho gen que codifica la segunda proteína exógena en el paso (b) , dicho gen que codifica la primera proteína exógena no se expresa esencialmente. 20

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha primera y dicha segunda proteínas exógenas son codificadas por genes de vectores diferentes.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha primera y dicha segunda proteínas 25 exógenas son codificadas por genes del mismo vector.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que uno o ambos de dichos genes que codifican dichas proteínas exógenas es o son introducidos en dicha célula huésped eucariota mediante una transinfección estable o mediante una infección transitoria.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha integración estable es efectuada mediante una integración específica de sitio como el sistema cre/lox o a través del sistema Flp-In.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas proteínas multiméricas contienen al menos 35 un sitio de unión al antígeno.

9. El método de la reivindicación 8 en el que dichas proteínas multiméricas que contienen al menos un sitio de unión al antígeno son inmunoglobulinas.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha primera y dicha segunda proteínas exógenas son capaces de formar una proteína multimérica.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dichos promotores eucariotas inducibles se eligen entre promotores sensibles a las hormonas, promotores sensibles a los metales, promotores sensibles al 45 choque térmico, promotores sensibles a los interferones y promotores sensibles a los antibióticos.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicho promotor se elige entre el promotor tet, el promotor de metalotioneína, el promotor GRE y el promotor sensible a la ecdisona.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha célula huésped de mamífero se elige entre una célula CHO, una célula PER.C6, una célula HKB11 y una célula HEK293.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además los pasos de 55 (c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de un gen que codifique una tercera proteína exógena, y, opcionalmente,

(d) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de incluso más genes que codifiquen proteínas exógenas.

Figuras Figura 1

Figura 2