Procedimiento de producción de koji líquido.

Un procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de enzimas,

comprendiendo cultivar mohos koji blanco y/o mohos koji negro en un medio líquido que contiene (i) un cereal cuya superficie está completamente cubierta con cáscaras y (ii) al menos una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en nitrato potásico, nitrato sódico, células de levadura, productos tratados de células de levadura, cáscaras de cereales y salvado de cereal.

Procedimiento de producción de koji líquido Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de koji liquido, específicamente, a un procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad enzimática potenciada.

Técnica anterior

En cuanto al koji usado en la producción de bebidas alcohólicas uno es el koji sólido, que se cultiva de forma que las esporas de los hongos filamentosos se inoculan en materia prima que se ha tratado con cocción y similares, y koji líquido, que se cultiva de forma que el medio líquido se prepara añadiendo materia parima y otras fuentes de nutrientes a agua y, después se inoculan esporas de hongos koji o micelios precultivados de mohos koji y similares.

En la producción convencional de alimentos y bebidas fermentados, tales como bebidas alcohólicas, incluyendo, por ejemplo, saque, shochu, salsa de soja, pasta de soja fermentada, saque dulce y similares, lo que se denomina koji sólido, que se prepara con el procedimiento de cultivo sólido, se ha usado ampliamente. El procedimiento de cultivo sólido es el procedimiento de cultivo en el que las esporas de mohos koji, tales como Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae y similares, se dispersan sobre materia bruta sólida, tal como cereales cocinados al vapor, para permitir el crecimiento de los mohos koji sobre la superficie sólida.

Por ejemplo, en la producción de shochu, el koji sólido, tal como Aspergillus kawachii y Aspergillus awamori, se ha usado ampliamente. No obstante, dado que el procedimiento de cultivo sólido es un sistema de cultivo en el que las materias primas y los mohos koji se dispersan de forma no homogénea, es difícil uniformar los factores tales como la temperatura, el contenido en agua y varias composiciones nutrientes, y el procedimiento de cultivo sólido es muy complicado en el control de cultivo. Además, la producción de koji a menudo se realiza en condiciones abiertas y se requiere precaución en términos de control de calidad para prevenir la contaminación con otras bacterias. Por tanto, el procedimiento de cultivo sólido no es adecuado para la producción a gran escala.

Por el contrario, el procedimiento de cultivo líquido es fácil en el control del cultivo y el control de calidad, por lo que es adecuado para una producción eficiente. No obstante, debido a la razón de que, por ejemplo, la actividad enzimática es insuficiente para fermentar shochu, el producto de cultivo obtenido mediante cultivo de mohos koji rara vez se usa como koji shochu. El producto de cultivo obtenido mediante el procedimiento de cultivo líquido puede ser un producto de cultivo obtenido mediante el procedimiento de cultivo líquido (en lo sucesivo en el presente documento también denominado "koji líquido"), así como líquido de cultivo, células y un concentrado de los mismos, o un porducto desecado de los mismos.

Además de las razones mencionadas anteriormente, un motivo fundamental de que no se use el producto de cultivo obtenido con el procedimiento de cultivo líquido para producir alimentos y bebidas fermentados tales como shochu es que se sabe que el comportamiento de los mohos koji para producir enzimas, tales como amilasa y celulasa en el cultivo líquido, es muy diferente del del cultivo sólido y su productividad también se sabe que es mala en general (véanse los documentos no de patente 1 y 2).

En la producción de las bebidas alcohólicas tales como shochu, el alcohol normalmente se genera mediante sacarificación y fermentación simultáneas. Por tanto, las enzimas sacarolíticas de los mohos koji, que afecta al suministro de glucosa a los mohos koji, en particular glucoamilasa y la a-amilasa estable en ácido son enzimas clave en la fermentación alcohólica. No obstante, se sabe que la actividad de la glucoamilasa es considerablemente baja en el producto de cultivo obtenido con el procedimiento se cultivo líquido y su comportamiento de producción también es muy diferente del del cultivo sólido (véanse los documentos no de patente 3 a 6).

Como procedimiento de mejora de la actividad glucoamilasa de los mohos koji, se ha notificado el procedimiento de cultivo de mohos koji destacando el crecimiento de micelios (véase el documento de patente 1) y el procedimiento de añadir cereales tostados al fluido de cultivo del moho koji (véase el documento de patente 2). El procedimiento divulgado en el documento de patente 1 produce cultivo sobre la membrana porosa o en agente de inmovilización que tiene huecos de aire para permitir la expresión del gen nuevo glaB que codifica la glucoamilasa para potenciar de este modo la actividad enzimática.

De acuerdo con lo anterior, el procedimiento requiere un control estricto o dispositivos de cultivo específicos y, por tanto, no es práctico. El procedimiento divulgado en el documento de patente 2, los cultivos de mohos koji en medio líquido usando cereales tostados como, al menos, una porción de la materia prima, que requiere una etapa de producción adicional de tostar cereales.

Los inventores de la presente invención proporcionaron una invención relacionada con un procedimiento de cultivar mohos koji usando medio líquido que contiene los sacáridos que los mohos koji apenas descomponen (véase el documento de patente 3). Cultivando los mohos koji en líquido con la invención, un producto de cultivo del moho koji

que tiene una actividad elevada de las enzimas glicolíticas tales como glucoamilasa, que se pueden usar para producir alimentos y bebidas fermentados tales como saque, se puede obtener de forma conveniente y económica,

Por otro lado, recientemente, se ha realizado el análisis biológico molecular en a-amilasa estable en ácido hasta los detalles (véase le documento no de patente 7). El análisis se ha notificado del siguiente modo: Un moho koji blanco 5 tiene dos genes de amilasa diferentes que son responsables, respectivamente, de dos características diferentes, es decir a-amilasa inestable en ácido y a-amilasa estable en ácido. Los comportamientos de expresión de los respectivos genes son muy diferentes entre sí. En el cultivo líquido, la -amilasa inestable en ácido se produce de forma suficiente, mientras que la -amilasa estable en ácido, una enzima clave para fermentar shochu, apenas se produce.

Para producir shochu, la fermentación se realiza en condiciones de pH bajo para prevenir la putrefacción de la pasta de malta de shochu. La amilasa inestable en ácido contribuye muy poco a la glicólisis en la fermentación del shochu porque se desactiva muy rápido en condiciones de pH bajo. Por tanto, es indispensable para producir shochu que la a-amilasa estable en ácido se produzca con un rendimiento elevado, que se piensa que contribuye a la glicólisis en la fermentación del shochu, mediante cultivo líquido de mohos koji.

El comportamiento de producción de la a-amilasa estable en ácido en cultivo líquido de mohos koji se ha investigado con detalle y se ha publicado. No obstante, el procedimiento usa medio sintético que contiene peptona y solución tampón de citrato, y requiera un tiempo de cultivo de 1 horas o más, por lo que sería difícil aplicarlo a la actual fermentación de shochu (véanse los documentos no de patente 8 a 1).

Como se ha descrito anteriormente, se piensa, en general, que la a-amilasa estable en ácido es la enzima que no se 2 puede producir básicamente cultivando en líquido y, por tanto, no se ha desarrollado koji líquido que tenga una actividad elevada de a-amilasa estable en ácido.

Se ha divulgado un procedimiento para producir arroz malteado líquido que tiene una concentración elevada de alcohol de azúcar (véase el documento de patente 4). Se ha preparado un fluido de cultivo de moho sumergido para pasta de malta de de vinagre de arroz (véase el documento no de patente 11). Se ha investigado el efecto de las 25 variaciones de cultivo y nutritivos sobre determinadas exoenzimas secretadas por los hongos (véase el documento no de patente 12).

Documento de de patente 1: JP 11 -225746 A Documento de de patente 2: JP 21 -321154 A Documento de de patente 3: JP 23-265165 A 3 Documento de de patente 4: JP 23-47455 A

Documento no de patente 1: Iwashita K. et al: Biosci.

Documento no de patente 1: Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946(1998)

Documento no de patente 2: Yuichi Yamane et al.: Journal of the Brewing Society of Japan, 99, 84-92(24)

Documento no de patente 3: Hata Y. et al. : J. Ferment. Bioeng. , 84, 532-537 (1997)

Documento no de patente 4: Hata Y. et al. : Gene., 27, 127-134 (1998)

Documento no de patente 5: Ishida H. et al.: J. Ferment. Bioeng. , 86, 31-37... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de enzimas, comprendiendo cultivar mohos koji blanco y/o mohos koji negro en un medio líquido que contiene (i) un cereal cuya superficie está completamente cubierta con cáscaras y (¡i) al menos una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en nitrato potásico, nitrato sódico, células de levadura, productos tratados de células de levadura, cáscaras de cereales y salvado de cereal.

2. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de enzimas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las enzimas comprenden glucoamilasa y a-amilasa estable en ácido.

3. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio líquido contiene:

un cereal cuya superficie está completamente cubierta con cáscaras;

al menos una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en nitrato potásico y nitrato sódico; al menos una sal fosfato seleccionada del grupo que consiste en dihidrógenofosfato potásico y fosfato amónico; y al menos una sal sulfato seleccionada del grupo que consiste en sulfato de magnesio heptahidrato, sulfato de hierro heptahidrato y sulfato amónico.

4. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de enzimas de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el medio líquido contiene la al menos una fuente de nitrógeno en una concentración de ,1 a 2,% (peso/volumen).

5. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el medio líquido contiene la al menos sal fosfato en una concentración de ,5 a 1,% (peso/volumen).

6. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el medio líquido contiene la al menos una sal sulfato en una concentración de ,1 a ,5% (peso/volumen).

7. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cereal comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en arroz crudo, arroz con todas las glumas, arroz con parte de las glumas y cebada que tiene una proporción de pulido no inferior al 93%.

8. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los mohos koji blancos comprenden Aspergillus kawachii.

9. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los mohos koji negros comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Aspergillus awamorí y Aspergillus niger.

1. El procedimiento de producción de koji líquido que tiene una actividad potenciada de las enzimas de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cereal comprende cebada.

11. Un procedimiento de producción de al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa y a-amilasa estable en ácido, que comprende producir la al menos una enzima cultivando mohos koji blanco y/o mohos koji negro en un medio líquido contiene (i) un cereal cuya superficie está completamente cubierta con cáscaras y (ii) al menos una fuente de nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en nitrato potásico, nitrato sódico, células de levadura, productos tratados de células de levaduras, cáscaras de cereales y salvado de cereales.

12. Un procedimiento de producción de al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en glucoamilasa y a-amilasa estable en ácido, celulasa y carboxipeptidasa ácida que comprende producir la al menos una enzima cultivando mohos koji blancos y/o mohos koji negros en un medio líquido, que contiene:

un cereal cuya superficie está completamente cubierta con cáscara;

al menos una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste en nitrato potásico y nitrato sódico; al menos una sal fosfato seleccionada del grupo que consiste en dihidrógenofosfato potásico y fosfato amónico; y al menos una sal sulfato seleccionada del grupo que consiste en sulfato de magnesio heptahidrato, sulfato de hierro heptahidrato y sulfato amónico.

13. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el medio líquido contiene la al menos una fuente de nitrógeno en una concentración de ,1 a 2,% (peso/volumen).

14. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el medio líquido contiene la al menos una sal fosfato en una concentración de ,5 a 1,% (peso/volumen).

15. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el medio líquido contiene la al menos una sal sulfato en una concentración de ,1 a ,5% (peso/volumen).

16. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que el cereal comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en arroz crudo, arroz con todas las glumas, arroz con

parte de las glumas y cebada que tiene una proporción de pulido no inferior al 93%.

17. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que los mohos koji blancos comprenden Aspergillus kawachii.

18. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que los mohos koji negros comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en Aspergillus awamori y Aspergillus niger.

19. El procedimiento de producción de enzimas de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que el cereal

comprende cebada.