Producción de ácidos grasos y derivados de los mismos.

Microorganismo que comprende una o más secuencias de acido nucleico oxígeno que codifican para una acetil-CoA carboxilasa (EC 6.

4.1.2), una acil-CoA sintasa (EC 2.3.1.86), una acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) y una tioesterasa (3.1.2.-, 3.1.1.-) para su uso en la producción de un alcohol graso, en el que dichas secuencias de acido nucleico se sobreexpresan.

Producción de ácidos grasos y derivados de los mismos Campo

Se proporcionan microorganismos modificados por ingeniería genética que producen productos de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), así como métodos de su uso.

Antecedentes

Los desarrollos en la tecnología han ido acompañados por un aumento en la dependencia de fuentes de combustible y tales fuentes de combustibles están volviéndose cada vez más limitadas y difíciles de adquirir. Al tener lugar la combustión de combustibles fósiles a una tasa sin precedentes, es probable que la demanda mundial de combustible pronto sea mayor que los suministros de combustible actuales.

Como resultado, se han dirigido esfuerzos hacia el aprovechamiento de fuentes de energía renovable, tales como luz solar, agua, viento y biomasa. El uso de biomasa para producir nuevas fuentes de combustible que no se derivan de fuentes de petróleo (es decir, biocombustible) ha surgido como una opción alternativa. El biocombustible (biodiésel) es un combustible inflamable biodegradable, de combustión limpia compuesto por ésteres y alcanos de cadena larga. Puede usarse biodiésel en la mayoría de los motores diésel de combustión interna o bien en una forma pura, que se denomina biodiésel puro", o bien como una mezcla en cualquier concentración con diésel de petróleo normal. Los métodos actuales de producción de biodiésel implican la transesterificación de triacilglicéridos (principalmente aceite vegetal) que conduce a una mezcla de ésteres de ácidos grasos y el producto secundario no deseado glicerina, proporcionando por tanto un producto que es heterogéneo y un producto de desecho que provoca ineficiencias económicas.

Sumario

Se dan a conocer en el presente documento microorganismos recombinantes que pueden sintetizar productos derivados de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (derivados de ácidos grasos), y opcionalmente liberar tales productos al caldo de fermentación. Tales derivados de ácidos grasos son útiles, entre otros, como biocombustibles y productos químicos especializados. Estos biocombustibles y productos químicos especializados pueden usarse para producir productos adicionales, tales como complementos nutricionales, polímeros, sustitutos de parafina y productos para el cuidado personal.

Los microorganismos recombinantes dados a conocer en el presente documento pueden modificarse por ingeniería genética para producir diversos derivados de ácidos grasos incluyendo, pero sin limitarse a, alcoholes de cadena corta tales como etanol, propanol, isopropanol y butanol, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, hidrocarburos y ésteres de ceras.

En un ejemplo, la descripción proporciona un método para modificar un microorganismo de modo que produzca, y opcionalmente libere, derivados de ácidos grasos generados a partir de una fuente de carbono renovable. Tales microorganismos se modifican por ingeniería genética, por ejemplo, introduciendo una secuencia de ADN exógeno que codifica para una o más proteínas que pueden metabolizar una fuente de carbono renovable para producir, y en algunos ejemplos secretar, un derivado de ácido graso. Los microorganismos modificados pueden usarse entonces en un procedimiento de fermentación para producir derivados de ácidos grasos útiles usando la fuente de carbono renovable (biomasa) como material de partida. En algunos ejemplos, se usa un microorganismo existente que puede tratarse genéticamente debido a la facilidad de modificación por ingeniería genética de sus rutas para controlar el crecimiento, la producción y reducir o eliminar reacciones secundarias que reducen la eficacia de la ruta de biosíntesis. Además, tales microorganismos modificados pueden usarse para consumir fuentes de carbono renovables con el fin de generar combustibles que pueden usarse directamente como biocombustibles, sin la necesidad de métodos especiales para su almacenamiento o transporte. En otros ejemplos, se modifican por ingeniería genética microorganismos que producen de manera natural hidrocarburos para que sobreproduzcan hidrocarburos expresando secuencias de ácido nucleico exógeno que aumentan la producción de ácidos grasos.

Se proporcionan en el presente documento microorganismos que producen derivados de ácidos grasos que tienen niveles de saturación, ramificación y longitud de la cadena de carbono definidos. En ejemplos particulares, la producción de productos homogéneos disminuye el coste global asociado con la fermentación y separación. En algunos ejemplos se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una cera sintasa (EC 2.3.1.15). En otros ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una alcohol acetiltransferasa (2.3.1.84). En aún otros ejemplos, se proporcionan microorganismos que incluyen una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14), al menos una acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) y al menos una alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1). También se proporcionan microorganismos que expresan una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para al menos una tioesterasa (EC 3.1.2.14) y al menos una acil-CoA reductasa que forma alcohol graso (1.1.1.*). Los péptidos de tioesterasa codificados por las secuencias

de ácido nucleico exógeno pueden elegirse para proporcionar productos homogéneos.

En algunos ejemplos el microorganismo que se modifica por ingeniería genética para producir el derivado de ácido graso es E. coli, Z. mobilis, Rhodococcus opacus, Ralstonia eutropha, Vibrio fumissii, Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis, Streptomycetes, Stenotrophomonas maltophila, Pseudomonas o Micrococus leuteus y sus microorganismos relacionados.

En otros ejemplos pueden modificarse por ingeniería genética microorganismos que producen hidrocarburos de manera endógena para sobreproducir hidrocarburos optimizando la ruta de biosíntesis de ácidos grasos tal como se describe en el presente documento. Los microorganismos a modo de ejemplo que se sabe que producen hidrocarburos y pueden modificarse por ingeniería genética para sobreproducir hidrocarburos usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento incluyen Arthrobacter sp., Bacillus sp., Botryococcus braunii, Chromatium sp., Ciadosporium resina (ATCC22711), Clostridium pasteurianum VKM, Clostridium tenanomorphum Clostridium acidiurici, especies de Corynebacterium, especies de cianobacterias (Nostoc muscorum, Anacystis (Synechococcus) nidulans, Phormidium luridum, Clorogloea fritschii, Trichodesmium erythaeum, Oscillatoria williamsii, Microcoleus chthonoplaseis, Coccochloris elabens, Agmenellum quadruplicatum, Plectonema terebraos, M vaginatus y C. scopulorum), Desulfovibrio desulfuricans (ATCC29577), Kineococcus radiotolerans (BAA-149), Micrococcus luteus (FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), Micrococcus sp. (ATCC 146, 398, 401, 533), Micrococcus roseus (ATCC 412, 416, 516), Micrococcus lysodeikticus, especies de Mycobacterium, Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma virida, Pullularia pullulans, Jeotgalicoccus sp. (M. candicans) (ATCC 8456), Rhodopseudomonas spheroids Clorobium sp., Rhodospirillium rubrum (ATCC 11170), Rhodomicrobium vannielii, Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), Saccharomycodes ludwigil (ATCC 22711), Saccharomyces sp. (oviformus, ludwigg, tropicalis), Vibrio fumissii M1, Vibrio marinus MP-1, Vibrio ponticus, Serratia marinorubra, Ustilago maydis, Ustilago nuda, Urocystis agropyri, Sphacelotheca reiiiana y Tilletia sp. (foetida, caries, controversa).

Además de modificarse por ingeniería genética para expresar secuencias de ácido nucleico exógeno que permiten la producción de derivados de ácidos grasos, el microorganismo pueden tener adicionalmente uno o más genes endógenos delecionados o atenuados funcionalmente. Por ejemplo, pueden atenuarse ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (registro NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), IdhA (EC 1.1.1.28), pflb (EC 2.3.1.54). plsB(EC 2.3.1.15), poxB(EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), glutatión sintasa (EC 6.3.2.3) y combinaciones de los mismos.

Además de modificarse por ingeniería genética para expresar secuencias de ácido nucleico exógeno que permiten la producción de derivados de ácidos grasos, el microorganismo pueden tener adicionalmente uno o más genes adicionales sobreexpresados. Por ejemplo, pdh,... [Seguir leyendo]

Microorganismo que comprende una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para una acetil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2), una acil-CoA sintasa (EC 2.3.1.86), una acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50) y una tioesterasa (3.1.2.-, 3.1.1.-) para su uso en la producción de un alcohol graso, en el que dichas secuencias de ácido nucleico se sobreexpresan.

Microorganismo según la reivindicación 1, en el que aproximadamente el 50% del alcohol graso producido se libera del microorganismo cuando se hace crecer a 37°C.

Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el microorganismo expresa además una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para fabA (EC 4.2.1.60), fabB (EC 2.3.1.41), fabD (EC 2.3.1.39), fabG (EC 1.1.1.100), fabH (EC 2.3.1.180), fabl (EC 1.3.1.9) y fabZ (EC 4.2.1.-).

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una secuencia de ácido nucleico endógeno atenuado que codifica para fadE (EC 1.3.99.3,1.3.99.-).

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho microorganismo expresa además una o más secuencias de ácido nucleico exógeno que codifican para una enzima seleccionada de uno o más componentes del complejo de la deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada (EC 1.2.4.4), Uve (EC 2.6.1.42), Ipd (EC 1.8.1.4), Ccr (EC 1.1.19), IcmA (EC 5.4.99.2), IcmB (5.4.99.13), fabH (EC 2.3.1.180), fabF (EC 2.3.1.179), fabH3 (EC 2.3.1.180), fabC3 (NP_823468), beta- cetoacil-ACP sintasa II (EC 2.3.1.180), enoil-CoA reductasa (EC 1.3.1.34), enoil-CoA isomerasa (EC 4.2.1.- ), y combinaciones de las mismas, en el que el derivado de ácido graso está ramificado.

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el alcohol graso comprende de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 dobles enlaces.

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el alcohol graso comprende una longitud de cadena de carbono de desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30.

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el alcohol graso comprende de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 puntos de ramificación.

Microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el microorganismo es E. coli.

Método de producción de un alcohol graso que comprende cultivar el microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones suficientes para producir un alcohol graso; y separar el alcohol graso.

Método de obtención de un alcohol graso purificado que comprende,

a) cultivar un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones suficientes para producir un alcohol graso;

b) permitir que el alcohol graso se separe en una fase orgánica; y

c) purificar el alcohol graso de la fase orgánica.