Procedimientos mejorados de producción de vacunas con base de levadura.

Una composición que comprende levadura de Saccharomyces, en la que la levadura expresa un antígeno heterólogo,

y en la que la levadura se ha cultivado en un medio que se mantiene a un nivel de pH de entre 5,5 y 8, de forma que el pH del medio no disminuya por debajo de pH 5,5, para su uso en un procedimiento de provocación de una respuesta inmunitaria en un individuo, como profiláctico o terapéutico para una enfermedad o afección

Procedimientos mejorados de producción de vacunas con base de levadura Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos de cultivo de cultivos de levadura a pH neutro para mejorar los rendimientos y ciertas características de los cultivos de levadura. El procedimiento también se refiere a composiciones producidas por estos procedimientos.

Antecedentes de la invención

Las vacunas son unas de las medidas más rentables disponibles para la industria del cuidado de la salud. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad urgente para desarrollar vacunas y adyuvantes seguros y eficaces para una variedad de enfermedades, que incluyen aquellas debidas a infección por agentes patógenos, cánceres, defectos genéticos y otros trastornos del sistema inmunitario. Publicaciones sobre vacunas, por ejemplo, Rabinovich y col., Science 265, 141-144 (1994), establecen que todavía existe la necesidad de vacunas seguras y estables al calor que puedan administrarse por vía oral y que necesitan administrarse solo algunas veces, preferentemente pronto en la vida. También se prefieren vacunas de combinación que puedan proteger individuos de más de una enfermedad, además de vacunas que no requieran un adyuvante y que puedan provocar inmunidad de la mucosa. Hasta la fecha hay muy pocas vacunas, si las hay, que cumplan todos estos criterios.

Las vacunas de subunidad, cuyo desarrollo se hizo posible por tecnología de ADN recombinante, han sido hasta la fecha decepcionantes ya que solo presentan inmunogenicidad limitada. Un ejemplo son las recientes pruebas clínicas de varias vacunas de subunidad del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) que se han detenido debido a la eficacia limitada de las vacunas, pero también debido a que en algunos casos los individuos inmunizados mostraron progresión acelerada de la enfermedad cuando se expusieron posteriormente al VIH; véanse, por ejemplo, Cohén, Science 264:1839(1994); y Cohén, Science 264: 66 (1994). Una desventaja de las vacunas de subunidad, además de las vacunas de virus muertos y virus vivos recombinantes es que, aunque parecen estimular una fuerte respuesta inmunitaria humoral, dejan de provocar inmunidad celular protectora. Una conclusión importante en la Conferencia Internacional sobre el SIDA de 1994 fue que sigue existiendo la necesidad de una respuesta mediada por linfocitos T citotóxicos que prevenga, o reduzca, la infectividad del VIH, que hasta la fecha falta en vacunas en la clínica. Además, las vacunas para el VIH probadas hasta la fecha han fracasado en provocar inmunidad en las superficies de la mucosa en las que se produce la infección primaria por el VIH.

Además, los únicos adyuvantes autorizados para su uso en los Estados Unidos son las sales de aluminio hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, ninguna de las cuales estimula la inmunidad mediada por células. Además, las formulaciones de sales de aluminio no pueden congelarse o liofilizarse, y tales adyuvantes no son eficaces con todos los antígenos.

Se han usado células de levadura en la producción de vacunas de proteína de subunidad (documento US2614986), que incluyen algunas de aquellas pruebas en los ensayos de vacunas para el VIH anteriormente mencionados. La levadura también se ha alimentado a animales antes de la inmunización para intentar sensibilizar la respuesta inmunitaria en un modo no específico (es decir, para estimular la fagocitosis, además de la producción del complemento e interferón). Los resultados han sido ambiguos, y tales protocolos no han generado inmunidad celular protectora; véanse, por ejemplo, Fattal-German y col., Dev. Biol. Stand. 77: 115-12 (1992) y Bizzini y col., FEMS-Microbiol. Immunol. 2: 155-167 (199).

Además de vacunas, muchas terapias génicas y de fármaco requieren vehículos de administración eficaces y específicos para garantizar el mayor beneficio posible. El carecer de un vehículo de administración adecuado es un obstáculo importante para la aplicación de terapia génica y limita significativamente el potencial terapéutico de muchos fármacos. Por ejemplo, informes recientes han indicado que los vectores de adenovirus, que están siendo actualmente probados en la clínica para aplicaciones de terapia génica, están estimulando respuestas inmunitarias e inflamatorias no deseables y no parecen ser integrantes de un modo deseado; véase, por ejemplo, Engelhardt y col., Human Gene Therapy 5: 1217-1229 (1994) y referencias citadas en su interior.

Otro obstáculo importante para la tecnología de vacunas de levadura es el procedimiento de fabricación. Las células de levadura se han cultivado en los laboratorios durante muchos años y se han establecido condiciones de cultivo estándar. Véase, por ejemplo, Methods of Enzymology, vol. 194, Guthrie y col., eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press (199). Los protocolos de operación estándar implican generalmente cultivar levadura en medio que es ácido como se mide por niveles de pH. Sin embargo, cultivar levadura en medio ácido puede hace que la levadura presente diferentes propiedades biológicas que no son óptimas para usar la levadura como vehículos portadores de antígeno para los fines de inmunomodulación o preparación de vacunas. Así, existe la necesidad de procedimientos de cultivo de levadura de forma que la levadura presente propiedades que la hagan más aptas para ser vehículos portadores de antígeno. La invención desvelada en el presente documento se basa, en parte, en el descubrimiento de que mientras que la levadura puede cultivarse en medio ácido, las propiedades biológicas que la levadura presenta cuando se cultiva en medio ácido no son tan deseables como cuando la levadura se cultiva en medio que está a niveles de pH neutro.

Breve resumen de la invención

Según la presente invención, se proporciona una composición que comprende levadura de Saccharomyces, en la que la levadura expresa un antígeno heterólogo, y en la que la levadura se ha cultivado en un medio que se mantiene a un nivel de pH de entre 5,5 y 8, de forma que el pH del medio no disminuya por debajo de pH 5,5, para su uso en un procedimiento de provocar una respuesta inmunitaria en un individuo, como un profiláctico o un terapéutico para una enfermedad o afección.

La Invención también proporciona un procedimiento de cultivo de levadura de Saccharomyces que comprende:

(a) cultivar la levadura en un medio que se mantiene a un nivel de pH de entre 5,5 y 8, en el que la levadura se cultiva de forma que el pH del medio no disminuya por debajo de pH 5,5, en el que la levadura se cultiva durante al menos tres horas o más a un nivel de pH entre 5,5 y 8, en el que la levadura expresa un antigeno heterólogo; y

(b) formular una composición que comprende dicha levadura y un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los presentes Inventores también describen un procedimiento de cultivo de levadura cultivando la levadura en medio en el que el medio se mantiene a un nivel de pH de entre 5,5 y 8 y en el que la densidad de la levadura es al menos ,5 unidades de levadura/ml.

En un aspecto de la Invención, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. En aspectos de la invención, el medio está tamponado con succinato o ácido succínico o el medio puede contener adicionalmente Soytone. En algunos casos, el antígeno heterólogo se expresa sobre la superficie de la levadura.

En algunos aspectos, el antígeno heterólogo está más fácilmente accesible para la interacción con otras células o agentes que cuando la levadura se cultiva a un pH inferior a 5,5.

La composición puede proporcionarse para su uso en un procedimiento de inducción de una respuesta tipo Th1 en un Individuo. En un aspecto, la respuesta tipo Th1 es la producción de ¡nterferón-gamma. En otro aspecto, la respuesta tipo Th1 es la producción de IL-12.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa los efectos de los niveles de pH del medio sobre el crecimiento celular y también sobre los niveles de pH del cultivo.

La Figura 2 representa el efecto de los niveles de pH del medio sobre el espesor de la pared celular.

La Figura 3 representa los resultados de probar diferentes tampones a un pH de aproximadamente 6,5. Se muestran los efectos sobre el crecimiento de células 75-15 y el cultivo pH.

La Figura 4 representa el efecto de diversos agentes de tamponamiento sobre el espesor de la pared celular, como se mide por la lisis por glucanasa. El medio de cultivo se tamponó usando tanto succinato como citrato para tamponar los medios de cultivo a un nivel de pH de aproximadamente 6,5.

La Figura 5 representa los resultados de un estudio de formulación de medios en el que se probaron diversos aditivos para su efecto sobre el... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende levadura de Saccharomyces, en la que la levadura expresa un antígeno heterólogo, y en la que la levadura se ha cultivado en un medio que se mantiene a un nivel de pH de entre 5,5 y 8, de forma que el pH del medio no disminuya por debajo de pH 5,5, para su uso en un procedimiento de provocación de una respuesta inmunitarla en un individuo, como profiláctico o terapéutico para una enfermedad o afección.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, para su uso en inducir una respuesta inmunitaria tipo Th1 en un individuo que está afectado con una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de una respuesta inmunitaria tipo Th1 potenciada.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la enfermedad o afección es una enfermedad infecciosa o cáncer.

4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el medio está tamponado con un agente de tamponamiento.

5. La composición, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el medio está tamponado con succinato.

6. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el medio está tamponado con Bis-Tris, citrato o fosfato.

7. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el medio se mantiene a un nivel de pH de entre 6 y 8.

8. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el antígeno heterólogo se expresa sobre la superficie de la levadura.

9. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

1. Un procedimiento de cultivo de levadura de Saccharomyces que comprende:

(a) cultivar la levadura en un medio que se mantiene a un nivel de pH de entre 5,5 y 8, en la que la levadura se cultiva de forma que el pH del medio no disminuya por debajo de pH 5,5, en la que la levadura se cultiva durante al menos tres horas o más a un nivel de pH entre 5,5 y 8, en la que la levadura expresa un antígeno heterólogo; y

(b) formular una composición que comprende dicha levadura y un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el medio se mantiene aun nivel de pH de entre 6 y 8.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el medio está tamponado con un agente de tamponamiento.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el medio está tamponado con succinato, Bis-Tris, citrato o fosfato.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el procedimiento comprende además liofilizar la levadura.