Procedimientos de liberación de esporoquistes de ooquistes usando fuerzas de cisión controladas.

Un procedimiento para liberar los esporoquistes de los ooquistes,

comprendiendo el procedimiento:

preparar una solución que contiene ooquistes en suspensión;

dejar que una corriente de alta presión de dicha solución colisione a velocidad ultraalta en un microcanal o cámara definido con precisión, en el que dicha presión alta varía de 7 a 41 MPa y en el que dicho microcanal o cámara está diseñado con geometría fija y está configurado para acelerar la corriente de un producto a velocidades altas suficientes para romper las paredes de los ooquistes y liberar los esporoquistes viables de ellos; y recuperar los esporoquistes liberados viables de la solución.

Procedimientos de liberación de esporoquistes de ooquistes usando fuerzas de cisión controladas Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para liberar los esporoquistes de ooquistes.

Antecedentes La coccidiosis aviar es una enfermedad provocada por protozoos parásitos del género Eimeria. Los ooquistes de la especie Eimeria están por todas partes en el entorno y persisten durante muchos meses en las heces de las aves. La ingestión de los ooquistes provoca una infección de las diversas regiones del tracto intestinal de forma específica de especie. El organismo prolifera en el intestino durante un periodo de varios días, provocando la excreción de la siguiente generación de ooquistes en las heces. Los múltiples ciclos de infección provocan inmunidad y cuando la infección se presenta en un corral de forma temprana y en una dosis uniforme entre los miembros del grupo, la inmunidad que se desarrolla con el transcurso de los diversos ciclos de exposición puede ser bastante potente.

Por el contrario, cuando las aves no están expuestas a la infección de manera uniforme, pueden surgir situaciones en las que las aves no expuestas se vean sometidas a una infección repentina y masiva, que provoque malos resultados en términos de conversión del alimento y de subida de peso, y un gran riesgo de infecciones secundarias. Actualmente, el procedimiento más habitual que se usa para el control de la coccidiosis en la industria aviar no es la vacunación, sino la administración de fármacos anticoccidiosis en el pienso. La baja tasa de uso de la vacunación se atribuye, a menudo, a la inseguridad sobre la uniformidad de la dosis a través del alimento o el agua en las instalaciones de engorde o en la vacunación en la cámara de pulverización en el criadero, que son las vías y tiempos de administración tradicionales. Existe un creciente interés en mejorar la uniformidad de la administración de las vacunas durante la administración en el criadero y proporcionar así una protección más uniforme al conjunto de las aves.

Recientemente, se ha encontrado que las técnicas de vacunación in ovo son aplicables a la administración de una vacuna contra la coccidiosis basada en ooquistes (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.500.438; la patente de Estados Unidos Nº 6.495.146 y la patente de Estados Unidos Nº 6.627.205; todas de Pfizer, Inc.) . La vía de administración in ovo proporciona un procedimiento conveniente de administrar una dosis uniforme de vacuna a cada embrión mientras todavía está dentro del huevo. La administración de las vacunas aviares in ovo se practica actualmente en aproximadamente 85% de los 9 billones de aves para carne que se producen en los Estados Unidos al año y un porcentaje cada vez mayor de los 21 billones de aves para carne que se producen fuera de los Estados Unidos al año (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.458.630 del gobierno de los Estados Unidos) . Por lo tanto, el mercado potencial para una vacuna viva contra la coccidiosis administrada in ovo es considerablemente mayor que el actual mercado para las vacunas contra la coccidiosis que se administran después de la eclosión.

Los ooquistes de Eimeria contienen cuatro esporoquistes dentro de la pared protectora del ooquiste. Los esporoquistes pueden usarse para diversos fines, que incluyen vacunas, pruebas de viabilidad, producción de esporozoítos, etc. Los procedimientos convencionales de lisar los ooquistes y liberar los esporoquistes utilizan esferas de vidrio. La agitación de los ooquistes con las esferas de vidrio provoca que la pared del ooquiste se abra y libere los esporoquistes que contienen. Por ejemplo, Dulski et al (Avian Diseases, American Association of Avian Pathologists, vol. 32, nº. 2, 1 de enero de 1988, páginas 235-239) divulgan un procedimiento e liberar y purificar esporoquistes y esporozoítos a partir e ooquistes de Eimeria tenella usando molturación de las esferas de vidrio a 200 rpm para liberar esporoquistes y usando gradientes de densidad en percoll para purificar. Otro procedimiento se describe por Coudert et al (Biotechnology Guidelines on Techniques in Coccidiosis Research, 1995, páginas 52 a 73) , que comprende una etapa de incubar los ooquistes a 4ºC en hipoclorito sódico al 20% de acuerdo con el método de Hosek y col. (descrito más adelante) , seguido de la alteración con un homogeneizador de Potter (teniendo cuidado de no usar demasiados golpes para evitar daños a los esporoquistes) . Sin embargo, generalmente se necesita una agitación considerable para partir un gran porcentaje de los ooquistes, y la acción de agitación continuada puede degradar los esporoquistes liberados previamente. Con otros procedimientos convencionales para liberar los esporoquistes existen problemas similares, como por ejemplo el uso de una trituradora tisular para liberar los esporoquistes. Los esporoquistes liberados al principio del proceso pueden ser destruidos al continuar el proceso de triturado.

Otros procedimientos convencionales para liberar los esporoquistes de los ooquistes se realizan liberando químicamente los esporoquistes de los ooquistes. Habitualmente, los ooquistes se suspenden en un tampón que contiene, por ejemplo, gas CO2. También puede incluirse clorhidrato de cisteína. Este procedimiento reduce los enlaces disulfuro de la región micropilar del ooquiste. Finalmente, los esporoquistes pueden liberarse a través de la caperuza micropilar laxa. Hosek y col. (J. of Protozoology, Vol 35, Nº. 4, 1988 páginas 583-589) describen dejar los ooquistes reposar durante 24 horas a 4ºC en hipoclorito sódico, seguido de agitación e incubación del sedimento de ooquistes lavado en una solución de exquistación durante de 1 a 2 horas a 41ºC. Desafortunadamente, la liberación química por sí sola no siempre es un procedimiento eficaz para la liberación de los esporoquistes.

Como tales, los procedimientos convencionales para la liberación de los esporoquistes de los ooquistes esporulados son ineficaces y proporcionan únicamente una fracción de los esporoquistes viables potenciales disponibles. De acuerdo con esto existe la necesidad de formas mejoradas de liberar los esporoquistes de los ooquistes y que solucionen los problemas asociados a los procedimientos convencionales.

Sumario A la vista de la exposición anterior, en el presente documento se proporciona un procedimiento para liberar esporoquistes de los ooquistes, comprendiendo el procedimiento: preparar una solución que contiene los ooquistes suspendidos en la misma; dejar que una corriente de alta presión de dicha solución colisione a velocidad ultrarrápida en un microcanal o cámara definida con precisión, en el que dicha presión alta varía de 7 a 41 MPa y en el que dicho microcanal o cámara está diseñada con una geometría fija y está configurada para acelerar la corriente de un producto a velocidades altas suficientes para romper las paredes de los ooquistes y liberar los esporoquistes viables; y recuperar los esporoquistes viables liberados de la solución. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se hace pasar una solución acuosa de ooquistes a través de una o más unidades de las cámaras del procesador Microfluidizer® bajo condiciones definidas de diámetro de la cámara, geometría de la cámara y presión. Los ooquistes impactan contra la pared de la cámara y se someten a fuerzas de cisión altas y controladas, rasgando la pared del ooquiste y liberando los esporoquistes intactos. Este procedimiento es particularmente eficaz para liberar los esporoquistes debido a que puede romperse un elevado porcentaje de paredes de los ooquistes, lo que permite recuperar un elevado porcentaje de esporoquistes. Además, se provocan pocos daños a los esporoquistes liberados permitiendo que un gran porcentaje de los esporoquistes recuperados sigan siendo viables.

En algunas realizaciones, los ooquistes se tratan para debilitar sus paredes antes de someter la solución a fuerzas de cisión controladas. Por ejemplo, los ooquistes pueden tratarse térmicamente, tratarse químicamente, tratarse enzimáticamente, o pueden someterse a diversas combinaciones del tratamiento térmico, químico y enzimático.

En algunas realizaciones, los esporoquistes recuperados se crioconservan para su almacenamiento. En algunas realizaciones, los esporoquistes recuperados se usan para preparar vacunas y/o para un ensayo de diagnóstico.

En algunas realizaciones, los esporozoítos se obtienen de los esporoquistes recuperados. Estos esporozoítos pueden usarse para preparar una vacuna y/o un ensayo de diagnóstico.

Los ooquistes de ejemplo de los que pueden recuperarse los esporoquistes, de acuerdo con realizaciones de la presente invención, son ooquistes... [Seguir leyendo]

1.Un procedimiento para liberar los esporoquistes de los ooquistes, comprendiendo el procedimiento:

preparar una solución que contiene ooquistes en suspensión; dejar que una corriente de alta presión de dicha solución colisione a velocidad ultraalta en un microcanal o cámara definido con precisión, en el que dicha presión alta varía de 7 a 41 MPa y en el que dicho microcanal o cámara está diseñado con geometría fija y está configurado para acelerar la corriente de un producto a velocidades altas suficientes para romper las paredes de los ooquistes y liberar los esporoquistes viables de ellos; y recuperar los esporoquistes liberados viables de la solución.

2.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dicha geometría fija está en una configuración en “forma de Y”

o una configuración en “forma de Z”.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha solución se pasa bajo presión a través de la cámara una o más veces.

4.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución comprende una solución acuosa.

5.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la presión usada para liberar los esporoquistes de los ooquistes de Eimera maxima varía de 7 a 34 MPa.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la presión usada para liberar los esporoquistes de los ooquistes de E. tenella o E. acervulina varía de 7 a 27 MPa.

7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que

(a) la cámara tiene una configuración en forma de Z o

(b) la cámara tiene una configuración en forma de Y.

8. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que:

(a) se proporciona una pluralidad de cámaras y además comprende seleccionar una cámara que tenga un diámetro que es sustancialmente igual o mayor que un diámetro de os ooquistes, y pasar la solución bajo presión a través de la cámara seleccionada, o

(b) se proporciona una pluralidad de cámaras en serie, teniendo cada cámara un diámetro respectivo diferente y que además comprende seleccionar una cámara que tenga un diámetro que es sustancialmente igual o más grande que un diámetro de los ooquistes y pasar la solución a presión a través de la cámara seleccionada.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende:

(a) tratar térmicamente los ooquistes para debilitar las paredes de los mismos antes de someter la solución al procedimiento de la reivindicación 1, o

(b) tratar químicamente los ooquistes para debilitar las paredes de los mismos antes de someter la solución al procedimiento de la reivindicación 1, o

(c) tratar enzimáticamente los ooquistes para debilitar las paredes de los mismos antes de someter la solución al procedimiento de la reivindicación 1, o

(d) usar una combinación de tratamiento térmico, químico o enzimático de los ooquistes para debilitar las paredes de los mismos antes de someter la solución al procedimiento de la reivindicación 1

10.El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende la crioconservación de los esporoquistes recuperados.

11.El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende preparar una vacuna y/o un ensayo de diagnóstico usando los esporoquistes recuperados.

12.El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende obtener esporozoítos de los esporoquistes recuperados.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende:

(a) determinar un porcentaje de los esporoquistes liberados de los ooquistes, o

(b) determinar un porcentaje de esporoquistes liberados que son viables. 14.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los ooquistes son ooquistes de Eimeria.

15. Un procedimiento para liberar esporozoítos de ooquistes, comprendiendo el procedimiento: preparar una solución que contiene ooquistes en suspensión; dejar que una corriente de presión alta de dicha solución colisione a velocidad ultrarrápida en un microcanal o cámara definida con precisión, en el que dicha presión alta varía de 7 a 41 MPa y en el que dicho microcanal o cámara está diseñada con una geometría fija y está configurada para acelerar la corriente de un producto a velocidades altas suficientes para romper las paredes de los ooquistes y liberar los esporoquistes viables; y recuperar los esporoquistes viables liberados de la solución.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha geometría fija es una configuración con “forma de Y” o una configuración con “forma de Z”.

17. El procedimiento de la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que dicha solución se pasa bajo presión a 10 través de la cámara una o más veces.

18.El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la solución comprende una solución acuosa.

19.El procedimiento de la reivindicación 15, que comprende tratar los ooquistes para debilitar sus paredes antes de someter la solución al procedimiento de la reivindicación 15.

20.El procedimiento de la reivindicación 15, que además comprende la crioconservación de los esporozoítos 15 recuperados.

21.El procedimiento de la reivindicación 15, que además comprende preparar una vacuna y/o un ensayo de diagnóstico usando los esporozoítos recuperados.